新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

多表位-表位疫苗诱导多中和表位特异性的抗HIV-1抗体

针对HIV-1包膜蛋白的中和抗体在体外高度有效地抑制不同病毒株的侵染，但在体内只以很低水平存在，提出多中和表位-表位疫苗作为提高体内中和抗体水平及机体抗病毒变异能力的新战略，两种候选从中和表位-表位疫苗在猴体内能同时诱导出预先确定的多中和表位特异性的抗体，这些抗体能识别表位多肽、gp41多肽、V3loop多肽、rsgp41和gp120上相应的中和表位，此外，3个实验型表位疫苗的组合（另一种形式的多中和表位-表位疫苗）在兔体内也诱导出类似的免疫应答。上述实验结果表明：多中和表位-表位疫苗可能是一种能同时诱导多重抗病毒活性、抗HIV-1感染以及对付病毒变异的新战略。     

H1N1流感病毒M1蛋白表位筛选及其在禽流感病毒交叉免疫中的作用机制

流感病毒,如2009甲型H1N1流感病毒(2009 pH1N1)以及发生跨种传播的H7N9禽流感病毒(H7N9)等的流行严重威胁了人类健康并造成了重大社会经济损失.自2009年以来, 2009 pH1N1作为季节性流感病毒的流行使得健康人群存在一定的T细胞免疫本底水平.本研究对2009 pH1N1和H7N9的主要T细胞免疫原M1蛋白存在的4个突变区段,利用ELISPOT试验确定了2009 p H1N1在这4个区段来源的T细胞表位多肽H1-M42 (LMEWLKTR), H1-M102(KLKREITFHGAK), H1-M202s (AMEVANQTR)和H1-M244 (MGVQMQRFK).同时,发现健康人群对H7N9来源的相应多肽预存有一定水平T细胞免疫,但低于对2009 pH1N1本身多肽的免疫水平.多肽与HLA分子的复性实验表明, H1-M102和H1-M244能够与HLA-A*1101稳定结合;而H1-M42和H1-M202s虽然能够结合HLA-A*3303,但H7N9相应的表位与这些分子的结合力相对较弱.结果表明,在健康人群中存在有限的针对H7N9的预存T细胞免疫,而H7N9在新鉴定表位多肽中的氨基酸突变对于免疫逃逸具有一定的贡献.对流感病毒交叉免疫的研究能够为了解禽流感病毒逃逸T细胞免疫机制以及通用流感疫苗的研发提供重要参考.     

大豆根瘤中增强表达的WIP小多肽基因家族的分子鉴定

小肽分子是植物细胞分化、器官形成和生物防御的重要信号分子.通过分析大豆全基因组DNA序列,发现大量的基因编码小肽前体即小多肽分子.到目前为止,对这些小多肽分子的特征以及功能知之甚少.本文系统地分析了公共数据库中的大豆转录组数据,鉴定了212个在根瘤中增强表达的小多肽基因.其中79个基因属于38个多基因家族,而另外133个基因不属于任何基因家族.在38个基因家族中,有10个基因家族只出现在豆科植物中,另外28个也出现在模式植物拟南芥中.在大豆中,最大的一个基因家族是伤流诱导的小多肽(wound-induced small protein,WIP)基因家族,由38个成员组成,其中一半左右的基因在大豆固氮根瘤中增强表达.我们进一步分析了蒺藜苜蓿、百脉根、拟南芥和水稻中的WIP同源基因,发现部分基因也在根瘤中增强表达或者受病原菌诱导表达.二级结构分析显示,WIP小多肽前体均含有一个DUF3774结构域,其中包含2个跨膜疏水区域,多数分子具有N-端信号肽序列.我们选取了2个大豆WIP基因进行亚细胞定位分析,发现WIP小多肽定位于细胞膜上.有趣的是,34个大豆WIP基因成簇分布在3条染色体上,与目前发现的其他小多肽基因家族的分散分布(如CLE)完全不同.在6,12和13号染色体上分别分布有11,12和11个WIP基因.而在12号染色体上的WIP同源基因则位于13号染色体上,二者呈对应关系.而6号染色体上的WIP基因相互之间同源性最高,且只与12号染色体上的基因具有较高的同源性.因此,可以推测,在大豆基因组中WIP基因可能起源13号染色体,通过染色体复制扩散至12号染色体,再扩散到6号染色体.而在拟南芥和水稻基因组中,半数以上的WIP基因也分布在一条染色体上,且与大豆12和13号染色体上的WIP基因具有较高的同源性.因此,植物中WIP基因可能来源一个共同的祖先.     

基于恶性疟原虫全基因组蛋白信息预测青蒿素的潜在抗疟靶点

结合NCBI分类数据库和KEGG提供的恶性疟原虫3D7株相关蛋白质信号通路信息, 筛选出8个处于信号通路关键位置的蛋白酶, 分别与青蒿素进行分子对接研究. 通过分析它们之间的结合模式, 发现嘌呤核苷磷酸化酶(pfPNP)、肽脱甲酰基化酶(pfPDF)和核糖-5-磷酸异构酶(pfRpiA)等3种蛋白酶与青蒿素的抗疟作用有关, 而青蒿素可能通过干预嘌呤代谢、嘧啶代谢、蛋氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及磷酸戊糖途径产生抗疟效应.     

恒河猴对人工设计的HIV-1 DNA疫苗的免疫反应

HAART对HIV/AIDS的治疗起到了重要的作用, 但研制有效的疫苗是解决该全球性问题的最终方案. 将人工设计的HIV-1多表位-p24 DNA疫苗质粒pVAX1-MEGp24大量制备并纯化后, 于0, 4, 8及18周肌肉注射免疫恒河猴, 分别在第3次免疫和第4次免疫后2周(第10与第20周)采集血液, 分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC), 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性, ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量, MTT法测定PBMC的增殖能力. 结果表明, HIV-1多表位-p24 DNA疫苗免疫组的恒河猴PBMC在恒河猴限制性HIV-1 CTL表位肽刺激下产生针对HIV-1靶细胞的特异性杀伤活性, 分泌Th1类细胞因子IFN-g和IL-2的水平升高, 并出现HIV-1特异性细胞增殖反应; 该重组疫苗同时能诱导恒河猴产生HIV-1特异性抗体. 结果提示, HIV-1多表位- p24 DNA疫苗能诱导恒河猴产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

一种病毒蛋白B细胞表位预测方法的建立

病毒蛋白抗原表位的预测对于设计免疫原性多肽、新型疫苗分子及诊断试剂均有帮助.但是,既往的预测方法并不多,且至少存在以下两方面的缺陷:(1)既往方法均基于一般蛋白质的实验结果,因此,到目前为止还没有1种专用于病毒蛋白的表位预测方法;(2)80年代后期以来,多肽固相自动合成技术和Geysen氏pin ELISA技术在免疫学的广泛应用、模拟位     

分子动力学模拟研究穿透肽的跨膜机制及引导新肽设计

细胞穿透肽在体内缺乏细胞和组织专一性,使得这类载体的临床应用受到很多限制.成功设计各类疾病特异性靶向穿透肽的关键是充分认识这类多肽的跨膜分子机制.分子动力学模拟已逐渐成为开展该领域研究不可或缺的重要工具,与实验研究相互促进,对特异性靶向穿透肽的设计具有重要的指导作用.目前,利用分子动力学模拟主要开展的研究内容包括跨膜过程、跨膜自由能变化、多肽序列结构特征以及不同细胞膜组成如何影响其跨膜机制等.随着分子模型及增强采样方法的发展,单组模拟能够直接快速获取多肽跨膜自由能和构象变化.因此,分子动力学模拟对如何改造或设计细胞靶向穿透肽提供理论依据和指导,对改善药物跨膜能力、减少药物对其他健康组织的毒害等方面有着重要的科学和实际意义.     

副黏病毒HN与F糖蛋白的结合作用域

副黏病毒囊膜表面糖蛋白有两种, 即与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN)以及介导膜融合的融合糖蛋白(F). HN与受体的结合可激活F, 使其发生构象变化, 从而介导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合, 但HN与F蛋白相互结合的区域还不清楚. 用基因工程方法获得禽副流感病毒-2(APIV-2)HN蛋白球状头部区域(globular head region, HNH)以及F蛋白两段七肽重复区域(heptad repeat, HR)HR1与HR2三个纯化蛋白. 蛋白质体外结合实验及质谱与圆二色谱的结果表明, HNH不仅可与HR2结合, 还可与HR1结合, 并且结合后的蛋白构象与各组成多肽的构象不同. 结果表明, HNH可能是HN蛋白与F蛋白的结合作用域. 在此基础上讨论了HN激活F并引致膜融合的分子机制, 可为阻止病毒膜融合寻找新策略.     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.     

乳腺癌细胞靶向特异性多肽研究

通过噬菌体肽库技术, 研究能特异性结合并具有携带目的基因进入靶细胞能力的多肽. 以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞, 与pC89噬菌体肽库共培养筛选出能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体. Subtilisin被用于灭活未进入细胞的噬菌体, 进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E. coli XLI-Blue得到扩增. 经5轮反复共培养, 富集得到能特异性进入乳腺癌细胞的小肽噬菌体. 以RGD-integrin binding噬菌体为对照, 分别检测乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株以及实体瘤细胞株的亲和性. 测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特异性多肽(CASPSGALRSC)以标记FITC; 同时为了解氨基酸序列排列对特异性的影响, 合成了调整氨基酸序列排列次序的多肽(CGSLSRAPSAC), 并检测其与人乳腺癌细胞的特异性. 实验获得与MDA-MB-231细胞特异性结合的小肽噬菌体; 合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列保持与MDA- MB-231细胞的特异性, 并且亲和性高于嵌合蛋白(RGD-integrin). 本研究建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知多肽的技术; 得到了一条能与MDA- MB-231高特异性结合的氨基酸多肽序列; 这种高特异性呈现氨基酸多肽序列高度依赖性; 该氨基酸多肽具有作为乳腺癌基因治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值.     

血管内皮细胞膜色谱模型的建立及初步应用

用体外培养的ECV304细胞, 以硅胶为载体制备ECV304细胞膜固定相, 建立了血管内皮细胞膜色谱模型, 并对固定相的表面特性和色谱特征进行考察. 应用血管内皮细胞膜色谱模型筛选药用植物红毛七中的活性成分, 通过色谱置换实验比较活性成分的竞争性作用, 并通过血管内皮细胞管腔形成实验进行初步药理学验证. 结果显示, ECV304细胞膜色谱模型在体外模拟配体与受体的相互作用, 在色谱条件下塔斯品碱有类似模型分子的保留行为, 能够选择性地作用于VEGFR2, 并显著抑制VEGF诱导的血管内皮细胞管腔形成, 表明血管内皮细胞膜色谱模型可以作为研究寻找特定活性分子的筛选模型.     

鉴定HIV-1包膜蛋白gp41的近膜端外部区与其 N端三聚体结构域之间的相互作用: 病毒融合相关的潜在机制

人类Ⅰ型免疫缺陷病毒(human immunodeficiency class I, HIV-1)包膜蛋白gp41的近膜端外部区(membrane proximal external region, MPER)在HIV-1的各个分化株之间相当保守, 这暗示MPER区对于病毒的生存和侵染均具有十分重要的作用. 目前研究表明, 两个靶向HIV-1且具有最广泛中和活性的单抗2F5和4E10, 都特异地识别该区域, 进而有效地抑制包膜蛋白介导的病毒膜融合过程. 我们先前的研究表明, 4E10抗体表位的抗原性和免疫原性会随着gp41融合核心区域的结构调整而发生显著的改变, 提示在gp41蛋白的MPER区与融合核心区之间很有可能存在某种联系, 并与gp41介导的膜融合过程相关. 本研究利用各种不同的gp41融合核心区衍生多肽, 检测了4E10表位多肽(D4E10P)与它们之间的反应性. 其中, 具有gp41蛋白核心区N-trimer结构的多肽(N-trimer-6HB)显示出很强的结合活性. 进一步对N-trimer-6HB多肽进行噬菌体文库筛选, 发现 4E10表位上一个短的模体序列(WF)很有可能对gp41的N-trimer和MPER区之间的相互作用发挥了至关重要的作用, 导致MPER区以潜在的方式参与病毒包膜和靶细胞膜间的融合过程.     

基于实验数据集对常用蛋白抗原空间表位预测工具的测评

抗体分子对蛋白抗原的结合主要通过表位区域进行, 而表位区域的氨基酸残基通常形成不连续的、构象的或者空间的表位区域, 而不是抗原表面上的线性连续片段. 已有许多算法可以用来预测构象表位, 并且基于各自的测试集, 各种工具对空间表位的预测都声称取得了杰出的效果. 本文收集了由实验方法确定的空间表位数据并建立了一套独立的测试集. 基于这套测试集, 采用灵敏度、真阳性预测率、成功挑选率和接受者操作特性曲线下面积(AUC)等参数对常用蛋白抗原空间表位预测工具进行了评估, 工具包括SEPPA, CEP, DiscoTope, ElliPro, PEPOP和BEpro等. 测试集评估结果表明, 6种蛋白抗原空间表位预测工具预测性能仍有待提高. 其中, SEPPA预测性能相对较好, 然而计算得到的灵敏度、真阳性预测率、成功挑选率和平均AUC值也并不理想. 评估结果还表明, 预测工具采用的空间表位训练和测试数据集以及预测算法对预测结果的准确性有较大影响. 以上分析结果为改进B细胞蛋白抗原空间表位预测方法和为免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计提供新的启示.     

水稻抗白叶枯病基因Xa-4的精细定位及其共分离分子标记

利用Ｘａ－４的近等基因系ＩＲ２４和ＩＲＢＢ４构建Ｆ_２群体，通过抗性鉴定筛选出感病植株，利用水稻高密度图谱上的分子标记和候选抗病基因片段进行分析，构建了抗白叶枯病基因Ｘａ－４的遗传图谱，并获得了与 Ｘａ－４共分离的分子标记 ＲＳ１３．构建的遗传图谱还包含另外５个紧密连锁的分子标记，其中１个是ＰＣＲ标记，４个是国际通用的水稻高密度图谱上的ＲＦＬＰ标记．为图位克隆Ｘａ－４打下了基础，也为分子标记辅助选择育种提供了有效的分子标记。     

LiCl对大鼠MSCs的动员效应及动员后细胞的分化潜能研究

为探讨LiCl动员间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的效应及动员后细胞的神经分化潜能. 用LiCl动员大鼠后, 以CFU-F分析其动员效应, 从形态学、表型分子的检测等对动员MSCs鉴定. 用b-巯基乙醇和神经元原代培养上清液诱导动员后MSCs向神经元分化. 结果表明, CFU-F分析显示LiCl可有效动员外周血MSCs, 形态学、表型分子等实验证实动员的细胞为MSCs, 并可被b-巯基乙醇和神经元原代培养上清液诱导, 表达神经元特异标志分子NSE, NF, Nestin和NeuN. 全细胞膜片钳记录到诱导后的MSCs有内向钠电流. 研究表明, 循环MSCs可被LiCl动员, 并在一定的环境下向神经元细胞分化, 这为神经损伤的修复提示了广阔的前景.     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性

将FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C基因单一/共同插入到鸡痘病毒载体pUTA-2和pUTA- 16LacZ中, 构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2P1和pUTAL3CP1, 分别与鸡痘病毒282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞, 经RT-PCR, IFA及Western杂交等方法筛选后成功获得携带有FMDV免疫原基因的两株重组鸡痘病毒株vUTA2P1和vUTAL3CP1. 应用2株重组鸡痘病毒株免疫小鼠, 经对免疫小鼠脾细胞中T细胞亚类计数、脾细胞CTL杀伤活性以及FMDV抗体的检测, 证明这2株重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应. 以鸡痘病毒为载体进行FMD基因工程活载体疫苗的研究为FMD的最终防治探索一种新的候选疫苗.     

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H₅N₁毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位, 检测了人禽流感H₅N₁毒株NA基因核苷酸序列. 采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案, 辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析, 并用SPSS 13.0进行聚类和相关分析, 建立了一种统计学筛选程序, 预测了H₅N₁病毒NA蛋白的B细胞表位, 并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析. 预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价. 结果发现, 预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120~137, 81~84, 408~415, 273~282, 429~432, 356~368, 46~55, 146~155, 341~350, 198~209肽段, 提示它们是B细胞表位的优势区段; 含有糖基化位点NGT_126~128的120~137肽段为首选的NA蛋白抗原表位; H₅N₁毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失, 这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性, 而且抗原表位扩大(VEP_46~48→VEPISNTNFL_46~55). 采用SWISS-MODEL软件建立的N₁蛋白模型有助于评价抗原表位预测. 结果表明, 用多参数预测以及用统计学筛选H₅N₁毒株NA蛋白的B细胞表位, 可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据; 广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性.     

水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立

稻米品质改良是水稻育种的重要方面, 传统的常规育种方法由于缺乏对目标基因有效检测的手段, 无法对稻米品质的基因型进行有效操作, 因而品质改良进展缓慢. 利用分子标记辅助选择与传统育种技术相结合, 可以在对稻米外观品质进行鉴定的同时, 对被选个体的基因型进行准确的鉴定. 结合品质的测定, 可以大大提高育种效率. 但是, 目前可用于稻米品质分子辅助育种的分子标记很少. 稻米品质与淀粉组分密切相关, 我们分析了16个典型水稻品种18个在淀粉合成中的重要基因的全基因序列, 明确了各个基因在不同种质中的等位变异, 设计了51个可以区分不同等位基因变异的分子标记, 这可为稻米品质的分子育种提供可靠的依据.