一种病毒蛋白B细胞表位预测方法的建立

病毒蛋白抗原表位的预测对于设计免疫原性多肽、新型疫苗分子及诊断试剂均有帮助.但是,既往的预测方法并不多,且至少存在以下两方面的缺陷:(1)既往方法均基于一般蛋白质的实验结果,因此,到目前为止还没有1种专用于病毒蛋白的表位预测方法;(2)80年代后期以来,多肽固相自动合成技术和Geysen氏pin ELISA技术在免疫学的广泛应用、模拟位     

鉴定HIV-1包膜蛋白gp41的近膜端外部区与其 N端三聚体结构域之间的相互作用: 病毒融合相关的潜在机制

人类Ⅰ型免疫缺陷病毒(human immunodeficiency class I, HIV-1)包膜蛋白gp41的近膜端外部区(membrane proximal external region, MPER)在HIV-1的各个分化株之间相当保守, 这暗示MPER区对于病毒的生存和侵染均具有十分重要的作用. 目前研究表明, 两个靶向HIV-1且具有最广泛中和活性的单抗2F5和4E10, 都特异地识别该区域, 进而有效地抑制包膜蛋白介导的病毒膜融合过程. 我们先前的研究表明, 4E10抗体表位的抗原性和免疫原性会随着gp41融合核心区域的结构调整而发生显著的改变, 提示在gp41蛋白的MPER区与融合核心区之间很有可能存在某种联系, 并与gp41介导的膜融合过程相关. 本研究利用各种不同的gp41融合核心区衍生多肽, 检测了4E10表位多肽(D4E10P)与它们之间的反应性. 其中, 具有gp41蛋白核心区N-trimer结构的多肽(N-trimer-6HB)显示出很强的结合活性. 进一步对N-trimer-6HB多肽进行噬菌体文库筛选, 发现 4E10表位上一个短的模体序列(WF)很有可能对gp41的N-trimer和MPER区之间的相互作用发挥了至关重要的作用, 导致MPER区以潜在的方式参与病毒包膜和靶细胞膜间的融合过程.     

新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

恒河猴对人工设计的HIV-1 DNA疫苗的免疫反应

HAART对HIV/AIDS的治疗起到了重要的作用, 但研制有效的疫苗是解决该全球性问题的最终方案. 将人工设计的HIV-1多表位-p24 DNA疫苗质粒pVAX1-MEGp24大量制备并纯化后, 于0, 4, 8及18周肌肉注射免疫恒河猴, 分别在第3次免疫和第4次免疫后2周(第10与第20周)采集血液, 分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC), 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性, ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量, MTT法测定PBMC的增殖能力. 结果表明, HIV-1多表位-p24 DNA疫苗免疫组的恒河猴PBMC在恒河猴限制性HIV-1 CTL表位肽刺激下产生针对HIV-1靶细胞的特异性杀伤活性, 分泌Th1类细胞因子IFN-g和IL-2的水平升高, 并出现HIV-1特异性细胞增殖反应; 该重组疫苗同时能诱导恒河猴产生HIV-1特异性抗体. 结果提示, HIV-1多表位- p24 DNA疫苗能诱导恒河猴产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

利用分子模拟技术筛选HLA-A2限制性CTL表位肽

以肿瘤抗原MAGE-2为例, 运用分子模拟方法对其4个优势候选HLA-A2限制性CTL表位进行初步鉴定, 再通过多肽结合实验对鉴定结果进行验证. 结果表明, 4个候选肽中有3个与HLA-A2分子有较好的亲和力, 进一步进行体外诱导CTL效应实验显示, 3个高亲和力的表位肽可在体外有效诱导特异性CTL效应. 利用计算机辅助鉴定CTL表位, 克服了以往筛选肽要将肽逐一洗脱下来的繁琐实验过程, 并且可直接观测到多肽复合物的结合模式, 该技术在筛选大量优势CTL表位中具有较大的应用价值.     

基于实验数据集对常用蛋白抗原空间表位预测工具的测评

抗体分子对蛋白抗原的结合主要通过表位区域进行, 而表位区域的氨基酸残基通常形成不连续的、构象的或者空间的表位区域, 而不是抗原表面上的线性连续片段. 已有许多算法可以用来预测构象表位, 并且基于各自的测试集, 各种工具对空间表位的预测都声称取得了杰出的效果. 本文收集了由实验方法确定的空间表位数据并建立了一套独立的测试集. 基于这套测试集, 采用灵敏度、真阳性预测率、成功挑选率和接受者操作特性曲线下面积(AUC)等参数对常用蛋白抗原空间表位预测工具进行了评估, 工具包括SEPPA, CEP, DiscoTope, ElliPro, PEPOP和BEpro等. 测试集评估结果表明, 6种蛋白抗原空间表位预测工具预测性能仍有待提高. 其中, SEPPA预测性能相对较好, 然而计算得到的灵敏度、真阳性预测率、成功挑选率和平均AUC值也并不理想. 评估结果还表明, 预测工具采用的空间表位训练和测试数据集以及预测算法对预测结果的准确性有较大影响. 以上分析结果为改进B细胞蛋白抗原空间表位预测方法和为免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计提供新的启示.     

HIV-1跨膜蛋白gp41的生物学功能——潜在的gp41细胞受体的研究

几年来 ,HIV 1跨膜蛋白 gp41的生物学功能研究又取得了重大进展 .几个研究小组提供的实验证据证实gp41有一个潜在的细胞受体 .一个重组的gp41胞外区多肽 (aa5 39～ 6 84)以及gp41的免疫抑制多肽 (aa5 83～ 5 99)能够连接人B淋巴细胞和单核细胞 ,仅能较弱的连接T淋巴细胞 .我们发现gp41有 2个细胞结合位点 (aa5 83～ 5 99和aa6 4 1～ 6 75 ) .gp41能够选择性地抑制人T ,B淋巴细胞和单核细胞的增殖 ,选择性地增强人MHCⅠ和Ⅱ类分子以及ICAM Ⅰ分子在细胞表面的表达 .针对第一结合位点的单克隆抗体和 gp41结合蛋白能抑制这种调节作用 .gp41和Ⅰ型干扰素之间存在氨基酸序列的同源性 ,同源区正位于gp41的第一结合位点和Ⅰ型干扰素的受体结合位点 .一些研究结果表明 ,gp41的 2个结合位点与HIV病毒感染细胞相关联 .含有 2个结合位点的多肽分别能够抑制HIV病毒感染细胞 .一个识别第二位点的单抗能广泛中和HIV_1的实验室病毒株和最新分离的病毒株 .此外 ,针对猴免疫缺陷病毒 (SIV)跨膜蛋白 gp32分子上 2个同源区的抗体能保护猴免受SIV的感染 .这些研究结果提示 :gp41细胞结合位点和细胞受体的研究定会对HIV病毒感染机理的研究和疫苗以及抗感染药物的研制产生重大影响 .     

CpG DNA增强口蹄疫病毒DNA疫苗诱发豚鼠产生的免疫应答

CpG DNA是一些具有免疫刺激作用的核苷酸序列,这些序列在DNA疫苗诱发机体产生的免疫应答中起着重要作用。设计并化学合成了一段含CpG DNA的寡核苷酸,将其插入编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶及O型口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白的表达质粒中,并观察了其对重组质粒介导的免疫应答的影响。结果显示,插入的寡核苷酸能增强重组质粒诱发豚鼠产生的病毒中和抗体及T细胞增殖反应,并能提高豚鼠的抗病毒感染能力,证明将CpG DNA克隆进DNA疫苗中提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。同时,构建的DNA疫苗为抗口蹄疫DNA疫羁的应用奠定了一定的基础。     

丙型肝炎病毒多表位抗原在小鼠与家兔中的免疫应答

在丙型肝炎病毒基因组中优选５个具有良好免疫原性的高度保守Ｔ／Ｂ细胞表位,组合成一个ＨＣＶ多表位抗原基因,并与β－并乳糖苷酶基因融合后在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达了具有ＨＣＶ免疫特异性的ＧＺ－ＰＣＸ抗原。     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

H1N1流感病毒M1蛋白表位筛选及其在禽流感病毒交叉免疫中的作用机制

流感病毒,如2009甲型H1N1流感病毒(2009 pH1N1)以及发生跨种传播的H7N9禽流感病毒(H7N9)等的流行严重威胁了人类健康并造成了重大社会经济损失.自2009年以来, 2009 pH1N1作为季节性流感病毒的流行使得健康人群存在一定的T细胞免疫本底水平.本研究对2009 pH1N1和H7N9的主要T细胞免疫原M1蛋白存在的4个突变区段,利用ELISPOT试验确定了2009 p H1N1在这4个区段来源的T细胞表位多肽H1-M42 (LMEWLKTR), H1-M102(KLKREITFHGAK), H1-M202s (AMEVANQTR)和H1-M244 (MGVQMQRFK).同时,发现健康人群对H7N9来源的相应多肽预存有一定水平T细胞免疫,但低于对2009 pH1N1本身多肽的免疫水平.多肽与HLA分子的复性实验表明, H1-M102和H1-M244能够与HLA-A*1101稳定结合;而H1-M42和H1-M202s虽然能够结合HLA-A*3303,但H7N9相应的表位与这些分子的结合力相对较弱.结果表明,在健康人群中存在有限的针对H7N9的预存T细胞免疫,而H7N9在新鉴定表位多肽中的氨基酸突变对于免疫逃逸具有一定的贡献.对流感病毒交叉免疫的研究能够为了解禽流感病毒逃逸T细胞免疫机制以及通用流感疫苗的研发提供重要参考.     

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H₅N₁毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位, 检测了人禽流感H₅N₁毒株NA基因核苷酸序列. 采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案, 辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析, 并用SPSS 13.0进行聚类和相关分析, 建立了一种统计学筛选程序, 预测了H₅N₁病毒NA蛋白的B细胞表位, 并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析. 预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价. 结果发现, 预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120~137, 81~84, 408~415, 273~282, 429~432, 356~368, 46~55, 146~155, 341~350, 198~209肽段, 提示它们是B细胞表位的优势区段; 含有糖基化位点NGT_126~128的120~137肽段为首选的NA蛋白抗原表位; H₅N₁毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失, 这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性, 而且抗原表位扩大(VEP_46~48→VEPISNTNFL_46~55). 采用SWISS-MODEL软件建立的N₁蛋白模型有助于评价抗原表位预测. 结果表明, 用多参数预测以及用统计学筛选H₅N₁毒株NA蛋白的B细胞表位, 可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据; 广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性.     

核酸抗体在新突发病毒性传染病防治中的应用

新突发病毒性传染病已在全球引起多起疫情的暴发流行,对人类健康、社会稳定和经济发展等造成了严重而深远的影响.目前,疫苗、小分子药物及抗体是预防和治疗新突发病毒性传染病的重要手段,但这些防治手段在实际应用过程中仍面临一些严峻的挑战,因而有必要快速开发一种新型的抗病毒策略.核酸抗体是指将编码特异性中和抗体的mRNA或DNA分子通过递送载体引入体内,然后利用宿主细胞的蛋白质合成机制来表达相应的抗体,进而发挥中和病毒的作用.核酸抗体作为一种新型的生物制剂,其制备工艺简单、易实现快速和大规模生产、应用范围广且便于储存和运输,因而在新突发病毒性传染病防治方面具有良好的应用前景.为此,本文主要综述了核酸抗体的原理及在抗病毒防治中的研究现状,重点阐明了核酸抗体的优势和不同核酸抗体类型的优缺点及其在未来发展中可能面临的严峻挑战和应对策略,以期为核酸抗体在新突发病毒性传染病防治中的应用提供新的研究思路.     

分子对接预测H5亚型禽流感病毒的广谱中和表位

H5N1禽流感病毒已经在亚洲、欧洲和非洲广泛传播, 造成了巨大损失. 最近我们鉴定出一株对多种来源的H5N1代表株均有良好中和活性的、识别H5亚型血凝素(hemagglutinin, HA)的广谱单克隆抗体8H5, 它对寻找克服禽流感高变性的广谱治疗性抗体、疫苗和药物具有重要价值. 本研究应用分子模拟技术, 采用“典范结构”方法对8H5抗体Fab片段进行结构模建, 并通过能量分析、SAS值分析、“拉曼强传图”检验、profile-3D分析等理论验证, 获得较为合理的8H5Fab的三维空间结构. 8H5Fab与3种HA蛋白晶体结构的分子对接结果表明, 8H5抗体与HA蛋白的作用模式与HA宿主来源无关, 但与HA结构的亚型相似性相关. 综合抗原同源比对结果, 推测8H5抗体识别的广谱中和表位是由HA上的Asp⁶⁸, Asn⁷², Glu¹¹², Lys¹¹³, Ile¹¹⁴, Pro¹¹⁸, Ser¹²⁰, Tyr¹³⁷, Tyr²⁵²不连续氨基酸残基组成的构象表位. 这一模型将为H5亚型禽流感病毒广谱疫苗和治疗性药物的分子设计提供依据.     

氨基酸广义疏水标度(GH-scale)用于HLA-A*0201限制性CTL表位定量预测

将天然氨基酸149个疏水性质经主成分分析得到了一种新氨基酸描述子——氨基酸广义疏水标度（GH—scale）．用GH—scale结合遗传偏最小二乘（GPLS）算法对152个HLA—A＊0201限制性CTL表位进行定量构效关系（QSAR）研究．所建模型拟合及交叉检验复相关系数分别为R^2cum=0．813和Q^2=0．725．研究表明，疏水作用在CTL表位与HLA—A＊0201结合过程中扮演极其重要角色，而锚定残基是该类作用发生最显著的部位．     

结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性

将编码结核分枝杆菌MPT-64，Ag85B和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA，经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述3种分泌蛋白的结构基因（包括信号肽）全序列，用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达，收集表达细胞或浓缩上清液，12%或15%的SDS-PAGE电泳分离，用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交，证明上述3种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白，3种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠21d后，Ag85B抗体的平均滴度即达到1：3200，第2次免疫21d达到1：102400，MPT-64抗体的平均滴度在首免21d后为1：50，第2次免疫21d后为1：200，两次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体，三免21d后Ag85B的特异性细胞因子γ-干扰素的浓度为110pg/mL；面MPT-64和ESAT-6的γ-干扰素浓度未检测到，实验在国内首次用结核杆菌多价DNA疫苗对小鼠进行了免疫实验，二免后的抗体水平已达到或超过国内外已报道的单价苗最高抗体水平，表明多价核酸疫苗和分泌型蛋白载体有利于增强疫苗的保护性应答。     

基质金属蛋白酶-26(MMP-26)在小鼠胚胎植入过程中的作用

基质金属蛋白酶-26（MMP-26，又称Endometase或基质水解素-2）是MMPs家族的一个新成员，它可在胎盘，子宫以及不同肿瘤细胞系中表达，采用子宫角注射，免疫组化，原位杂交，胚泡与子宫上皮单层培养，免疫印迹，RT-PCR和RNA印迹等多种体内外实验方法研究并报道了MMP-26在小鼠胚胎中的表达以及MMP-26抗体在胚胎植入中的作用，研究表明，MMP-26的mRNA与蛋白在小鼠胚泡中均有强烈的表达，此外，体内研究显示，MMP-26抗体能显著抑制小鼠胚胎的着床；在体外培养体系中，MMP-26抗体可显著抑制小鼠胚泡在子宫上皮单层上的黏附与扩展；同时，MMP-26抗体以剂量依赖关系抑制整合素αV亚基mRNA和蛋白的表达，研究提示，MMP-26可能直接或间接参与滋养层细胞侵入子宫内膜的过程，促使小鼠胚泡成功植入。     

水稻OsSH3P2短肽多克隆抗体的制备和鉴定

特异性抗体的成功制备是研究蛋白功能的重要环节,目前短肽抗体制备技术在动物中的应用日益成熟,然而该项技术在植物中的应用甚少.本研究通过分析水稻OsSH3P2蛋白的抗原表位、亲水性以及同源蛋白氨基酸序列,同时利用RoseTTAFold系统进行蛋白模型预测.选取了3条序列特异、亲水性高、具有抗原表位和不同肽链结构的氨基酸序列,通过人工合成短肽抗原、偶联KLH载体蛋白后,免疫新西兰大白兔制备得到相应多克隆抗体.经酶联免疫吸附测定检测获得了3份Anti-OsSH3P2-1#、Anti-OsSH3P2-2#、Anti-OsSH3P2-3#高效价短肽多克隆抗体血清.用免疫印迹(Western blotting)方法对OsSH3P2原核重组蛋白和植株内源的OsSH3P2蛋白进行检测,以进一步确定短肽抗体的特异性.结果显示,由不含α-螺旋和β-折叠结构的肽段作为抗原,免疫制得的Anti-OsSH3P2-1#短肽多克隆抗体能有效识别OsSH3P2蛋白,且不受同源蛋白干扰,说明该抗体具有较高的免疫特异性. OsSH3P2短肽多克隆抗体的成功制备,为进一步挖掘OsSH3P2生物学功能奠定基础,且为植物短肽抗体...     

伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异引起的病毒致弱作用

为揭示PRV tk基因结构与毒力的相互关系，tk基因结构变异对病毒生物学特性的影响和探讨病毒的致弱机理，以伪狂犬病毒湖北株（PRV HB）为材料，用BUdB诱变选择，分离出BUdR抗性的PRV TK^-突变株。在对野毒株和TK^-突变株tk基因克隆和测序的基础上，分析比较了两种毒株tk基因的一级结构。测定的PRV HB野毒株tk基因片段长1587bp，GC含量为72．7％。包含一个1098bp的ORF。编码366个氨基酸残基组成的蛋白。ORF内有2个137bp核苷酸的重复序列，两者以一个A连接。测定的TK^-突变株tk基因片段长1458bp，野毒株中137bp重复序列之一和连接A被自然删除，另有一个8核苷酸（GCGCGCCC）重复片段的插入，其他所有核苷酸与野毒株一致。在TK^-突变株中因核苷酸片段的缺失和插入，tk基因发生移框突变，导致转译提前终止，不能产生有功能的TK蛋白。氨基酸序列分析显示，PRV HB TK具有疱疹病毒TK共有的保守功能区并多出一个保守的DRH功能位点。实验还证实，TK^-突变株具有生物学遗传稳定性。与野毒株比较，其毒力显著降低。用TK^-突变株种小鼠，能诱导小鼠产生针对PRV强毒株致死攻击的有效保护。     

胞内共生菌Wolbachia内噬菌体相关尾蛋白基因的分子克隆及特征分析

Wolbachia是一种广泛存在于各种节肢动物体内经母系细胞质遗传的胞内共生菌。它能够改变宿主的生殖和发育行为，引起细胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility,CI)、孤雌生殖、雌性化和雄性致死等现象，但是其间的分子生物学机理迄今尚不清楚。采用RDA（representational difference analysis,代表性差异分析）和LM－PCR（ligation-mediated PCR)等方法，通过研究Wolbachia不同品系基因组之间的差异，从来自果蝇Drosophila melanogaster CantonS的Wolbachia(wMelCS)中克隆到了噬菌体相关尾蛋白基因prtp(phage-related tail protein)，同时从果蝇Drosophila melanogaster yw67c23中的Wolbachia(wMel)中克隆到了同源基因。通过研究prtp在不同Wolbachia品系间的表达，发现PrTP可能不直接参与CI过程。体外果蝇S2细胞的瞬时转染实验结果证明了prtp基因内双向核定位序列（bipartite nuclear localization signal sequence,NLS)的功能，prtp基因的存在为噬菌体介导的基因水平转移（horizontal gene transfer,HGT)提供了直接证据，并提示其在Wolbachia的生殖特性中可能扮演重要的角色。