β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明：该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp．NW-2004a，并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库，且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆．对其中一阳性克隆中插入的DNA片段（命名为GLUD）进行序列测定，发现了一长度为2502bp的开放阅读框（ORF），可编码834个氨基酸．BLAST分析结果表明，该基因与Bacillus sp．KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86％相似性，所编码的多肽与Bacillus sp．KSM-64来源的β—1，4-内切葡聚糖酶具89％的相似性，故该基因是一新发现的β—1，4-内切葡聚糖酶基因．该序列已收录于Genebank，登录号AY663839．另外，以cpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1，4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625Glu，最后通过平板检测及SDS—PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达．     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶的克隆与表征

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillus sp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG.经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最造反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性,50℃时半衰期达101h.Km值为20.1 g/L,相应的Vmax...     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

巨大芽孢杆菌AP25内切葡聚糖酶基因的克隆及序列测定

从土壤中分离到一株产纤维素酶的巨大芽孢杆菌AP25,经羧甲基纤维素平板检测,该菌可产生葡聚糖内切酶。根据GenBank登录的β-1,4内切葡聚糖酶基因（DQ782954．1,M28332．1,AY859492．1）的同源性序列,利用PCR方法克隆到该酶的基因,并对其进行测序。测序结果显示其全长为1500bp,推测其含499个氨基酸。与GenBank中的已知葡聚糖内切酶相比较,发现该酶的氨基酸序列与Bacillus subtilis的β-1,4内切葡聚糖酶基因同源性达到达94％。     

嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

首先通过引物设计扩增嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,然后采用Not I和Xho I双酶切目的基因与载体pPICZα-A,通过T4连接酶连接后转化DH5α菌株,挑取阳性克隆进行测序,测序正确阳性克隆放大培养,大量提取质粒,并采用限制性内切酶Sac I线性化质粒,电转化感受态酵母细胞,经培养后挑选转化子分别对应点种到MM、MD平板,并利用ZeocinTM获得多拷贝重组子,最后经甲醇诱导,并于48、54 h取样,经SDS-PAGE分析,结果表明整合嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶的毕赤酶母工程菌株构建成功.     

匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到其内切葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行表达.该内切葡聚糖酶基因大小为954bp,将其与pPIC9K质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,利用T4连接酶进行连接.将线性化后的重组质粒转化毕赤酵母GS115,并利用MD平板和刚果红平板进行筛选.阳性克隆经甲醇诱导培养84h后,产生的内切葡聚糖酶酶活力达到峰值为1.754IU/mL.     

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

豹蛙酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据豹蛙酶的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计引物,重叠延伸PCR法合成出目的基因,约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+)中,重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中。转化的重组大肠杆菌用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导外源基因表达,采用Tricine-SDS-PAGE系统,分析目标蛋白主要以包涵体形式存在,其质量分数可达48.8%。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白,通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析,其覆盖率达到35%,确定了其蛋白质一级结构的正确性。     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

抗CEACAM5纳米抗体在大肠杆菌中的高效周质表达

纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强以及能够穿过血脑屏障等众多优势,而且其能够通过大肠杆菌、酵母等简单微生物大量表达。大肠杆菌周质表达纳米抗体是目前纳米抗体制备主要的方法之一,但是纳米抗体的表达水平还相对较低。以pET22b和pMES4为载体构建了两种重组表达质粒,并且比较了他们在不同宿主菌中表达纳米抗体的情况。结果表明,以pMES4为载体的大肠杆菌能够在周质中可溶性表达纳米抗体,而以pET22b为载体的大肠杆菌表达的纳米抗体无法分泌到周质空间中。随后,通过IPTG浓度优化及5 L发酵罐过程,控制实现了纳米抗体在大肠杆菌周质中的表达量达到308. 32 mg/L。研究提供了一种高效表达纳米抗体的方法,为纳米抗体的规模化制备奠定了技术基础。     

兔脑组织因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达

重组组织因子(recombinant tissue factor,rTF)是新一代凝血酶原时间检测(PT)试剂的主要成分.从新鲜兔脑组织提取总RNA,通过RT-PCR得到TF全长编码基因,并克隆到pMD19-T载体.以测序验证正确的重组子为模板,扩增TF基因并构建成融合表达质粒pMAL-c2X-TF,并将其转化到DH5α中.SDS-PAGE和Western blotting证明,菌体诱导后形成可溶性的融合表达产物,该融合蛋白通过亲和层析纯化和凝血因子X a水解成为游离的TF蛋白,该蛋白通过脂化,制备成重组PT试剂.凝血试验表明,该试剂对血浆有明显的促凝活性.     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

鸭病原性大肠杆菌I型及P型菌毛表达条件的研究

为探讨鸭病原性大肠杆菌Ⅰ型及P菌毛在体外的表达条件,用三株分别带有Ⅰ型菌毛编码基因（fim＋）,Ⅰ型和P型菌毛编码基因（fim＋／papA＋）和P型菌毛编码基因（papA＋）的鸭病原性大肠杆菌SWY-098、SWY-009、SWY-027菌株,通过对鸡、鸭和豚鼠RBC的MSHA和MRHA试验,分别从培养温度、培养时间和培养基三个方面对菌毛在体外的表达进行优化．结果表明：三株鸭病原性大肠杆菌在37℃表达菌毛,在18℃不表达菌毛;用BBL培养基37℃静止培养48h是Ⅰ型和P型菌毛在体外表达最适宜条件．