水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

一个特殊的顺式发夹核酶对感染烟草原生质体的影响

研究一个烟草花叶病毒(TMV)cDNA3′末端被特异切割的发夹核酶对感染原生质体的作用。选用一个外源基因绿色水母荧光蛋白(GFPuv)作为报道基因，取代了大部分的CP编码区域，以研究在烟草原生质体中发夹核酶对TMV载体的复制，通过GFP的表达来确定表达量。顺式发夹核酶对TMV载体感染效率的影响通过体外转录来观察。TMV GFPRIB体外转录感染原生质体的效率比与其不含该核酶的对应物的感染效率高3～5倍。Northern杂交结果表明，包括核酶在内的3’末端非病毒序列在体外转录反应开始后就被顺式发夹核酶切除了。当直接用载体DNA pSTMVGFPRIB感染原生质体时，感染原生质体的数量比与之相对应的pSTMVGFP NOS感染原生质体数多50％～80％。     

NAC1启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NAC1上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NAC1启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达.进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导.初步说明NAC1基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因.     

在Hep G2细胞中利用siRNA沉默GFP基因的实验探讨

目的:通过探讨小分子双链RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制沉默肝癌细胞株Hep G2荧光素报告基因GFP的各项生物学指标,为进一步实验和临床研究提供依据.方法:通过体外实验,对siRNA和siRNA脂质体的稳定性和细胞毒性进行评估;通过荧光标记技术,研究不同时间siRNA脂质体的转染效率;通过荧光显微镜下观察转染细胞和RT-PCR检测靶基因mRNA表达,确定不同种类、形式、剂量的siRNA对靶基因的沉默效能.结果:在空白培养液中,siRNA和siRNA脂质体可稳定至4h,在5%血清中2～4h后明显降解;100nM的siRNA和siRNA脂质体无明显细胞毒性;siRNA脂质体转染细胞株的效率随时间不同而不同,4h可达90%;非特异性siRNA/脂质体无沉默靶基因表达作用,特异性siRNA/脂质体对靶基因的沉默作用在一定范围内随剂量升高(20nM、50nM、100nM)而升高.结论:siRNA的稳定性可满足实验需要,且无明显细胞毒性,特异性siRNA转染肝癌细胞株能有效抑制靶基因表达,用脂质体转染可提高转染效率.siRNA通过RNAi机制沉默靶基因表达,为肿瘤的治疗和基础研究提供了新的工具和思路.     

GFP标记的GDNF重组腺病毒载体的构建和体内外表达

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)共表达的腺病毒载体,讨论其在治疗脊髓和脑有关神经系统疾病的潜在应用价值,了解腺病毒载体在大鼠体内的分布及在体外分泌外源基因产物能力,并对其生物安全性作了初步考察,为GDNF重组腺病毒载体在临床和基础研究中的应用作了一定准备．     

Nuclear localization of mouse fibroblast growth factor 2 requires N-terminal and C-terminal sequences

In vertebrates, different isoforms of fibroblast growth factor 2 (FGF2) exist, which differ by their N-terminal extension. They show different localization and expression levels and exert distinct biological effects. Nevertheless, genetic inactivation of all FGF2 isoforms in the mouse results in only mild phenotypes. Here, we analyzed mouse FGF2, and show that, as in the human, mouse FGF2 contains CTG-initiated high molecular-weight (HMW) isoforms, which contain a nuclear localization signal, and which mediate localization of this isoform to the nucleus. Using green fluorescent protein-FGF2 fusions, we furthermore observed, that C-terminal deletions disable nuclear localization of the short low-molecular-weight (LMW) 18-kDa isoform. This loss of specific localization is accompanied by a loss in heparin binding. We therefore suggest that, first, localization of mouse FGF2 is comparable to that in other vertebrates and, second, FGF2 contains at least two sequences important for nuclear localization, a nuclear localization sequence at the N terminus which is only contained in the HMW isoform, and another sequence at the C terminus, which is only required for localization of the LMW 18-kDa isoform. Received 1 July 2003; accepted 14 August 2003     

植物幼小原胚的电激转化

用电激法将外源报告基因导入植物原胚获得瞬间表达．用酶解和显微解剖法分离出烟草含８～３２个细胞的幼小原胚与含２５０～４００个细胞的球形胚，导入ＧＵＳ和ＧＦＰ基因后，置于ＫＭ８ｐ培养基 １～２ｄ．当电场强度为 ５００～１５００ Ｖ／ｃｍ时，可检测到 ＧＵＳ蓝色反应和 ＧＦＰ绿色荧光，其中幼小原胚在电场强度为 ７５０ Ｖ／ｃｍ时，外源基因瞬间表达频率最高，为 ２．２％，球形胚在电场强度为１２５０ Ｖ／Ｃｍ时表达频率最高为 ５．９％．若以转化细胞占胚细胞总数的比例为有效转化频率，则幼小原胚的有效转化频率约为球形胚的７倍．     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

Dissection of SARS Coronavirus Spike Protein into Discrete Folded Fragments

Introduction Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), which is the causative agent of the atypical pneumonia, was first identified in the fall of 2002 to be a previously unknown member of the family of coronaviruses[1]. The rapid transmis…     

DNA甲基转移酶抑制剂DAC对AcMNPV感染的影响

通过DNA甲基转移酶抑制剂DAC(地西他滨,decitabine)改变DNA甲基化水平,研究杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)DNA的甲基化与病毒复制和基因表达调控的关系。通过流式细胞术和病毒mRNA的Real-time PCR检测发现,低浓度DAC(30nmol/L)处理细胞后会使报告基因绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein gene,gfp)的表达提前,且表达水平明显上升。对低浓度DAC处理组和对照组产生的病毒效价监控表明,低浓度DAC的存在可以提高病毒的效价。经连续DAC处理,在第六代细胞中生产的AcMNPV多角体感染甜菜夜蛾后,幼虫死亡率明显高于对照组。这些结果表明,DAC对杆状病毒DNA复制和基因表达具有一定作用。