重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和鉴定

用PCR将化学合成的人胸腺肽α1基因扩增并克隆到pMD18-T载体中,经过KpnI／SacI酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b中硫氧还蛋白下游．将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Zn—Sepharose亲和层析纯化以及复性处理,从每升菌液中可获得35mg硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白．经凝血因子Xa酶切、Zn—Sepharose亲和层析以及反相高效液相色谱纯化获得3．8mg重组人胸腺肽．小鼠胸腺细胞凋亡实验表明,重组人胸腺肽能显地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡,且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系．     

重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

人脑钠素(hBNP,humanbrainnatriureticpeptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素.临床研究表明,hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物.化学合成脑钠素全基因,以pET32a为表达载体,构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin＿hBNP)融合蛋白表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25%以上.融合蛋白经肠激酶裂解、Zn＿Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析,从每升培养液中可获取4mgrhBNP,纯度达到95%.经质谱测定,rhBNP样品的分子量为3464Da.体外活性测定结果表明,rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应,其ED50为(2.24±0 58)×10-6mg/mL.     

尿激酶原活性测定方法研究

以双链尿激酶国际标准品（IS）为对照，用显色底物法和凝块溶解法测定糖基化和非糖基化的尿激酶原的酶活性，结果表明与凝块法相比，显色底物法测定两种形式的尿激酶原的酶活力相近，测量误差小，重复性好，更适于产品的质量控制。     

一种具有抗肿瘤活性的新型尿激酶原Kringle结构域变体蛋白的研究

利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogen Kringle 5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在．通过体外复性,得到可溶性的prourokinase Kringle及其变体．所得蛋白质经过动物肿瘤模型测活,确定变体蛋白具有抑制肿瘤生长作用．     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20％,表达产物经体外变复性、TI—Sepharose亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95％以上,比活大于500000IU／mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准．其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符．同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究．     

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究     

重组人尿激酶原药代动力学的研究

第一部分 :采用交叉设计 ,自身比较 ,研究了猕猴静脉注射 0 .4 ,0 .8和 3.2mg·kg- 1 重组人尿激酶原 (rhprouk)或 1.2 8× 10 5IU·kg- 1 尿源性天然尿激酶 (un UK) (其中推注 15 %剂量 ,90min内恒速滴注 85 %剂量 )后血浆中单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu PA)和双链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (tcu PA)的浓度随时间变化、代谢转化和各自的药代动力学 ,及代谢转化和药代动力学参数与剂量浓度的依赖关系 .结果表明给药后scu PA转化为tcu PA的速度与scu PA的剂量呈正相关性 .第二部分 :通过测定兔静脉推注加滴注1 2 5I rhprouk 0 .8mg·kg- 1 (其中 15 %剂量静脉推注 ,85 %剂量在 90min内滴注 ,比放射活性 2 .5 0 6MBq/mg)后不同时间体内各组织总放射性、TCA酸沉放射性 ,以及酸沉和总放射性的比值 ;胆汁引流物放射性累计排出量 ,尿和粪中累计排出量 ,及在体内外1 2 5I rhprouk与血浆蛋白的结合 .研究rhprouk在体内的分布、代谢及排泄情况 .结果表明rhprouk不与血浆中蛋白结合 ,代谢部位主要集中在胆、肾等部位 ,代谢产物主要随小便排出 .     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．