天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将pSC101质粒上的Par区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒pXZ70上，构建成重组质粒pZZ1，将pZZ1质粒转化入大肠杆菌JM109细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养100代后，含质粒菌数仍在90％以上．     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.     

人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究

构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒pcDNA3.1( )/tPA,并研究其有无生物学活性.用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,对pcDNA3.1( )/tPA进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1( )/tPA转染血管平滑肌细胞,分别用Nothern Blot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1( )/tPA真核表达质粒,pcDNA3.1( )/tPA转染VSMC后,tPA mRNA和蛋白质表达增加,所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性.     

CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响

对于E.coli菌株用8种不同浓度的CaC l2制备感受态细胞,然后转化各浓度的感受态细胞。实验结果表明,不同浓度CaC l2溶液处理所得到的感受态细胞,其转化效率有很大的不同。随着CaC l2浓度增高,转化效率也随之提高,在80m mol/L~100m mol/L时达到峰值,进一步提高CaC l2的浓度,转化效率急剧下降。还探讨了-70℃贮存时间对转化效率的影响。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

pDNA-巯基壳聚糖纳米粒的制备及Box-Behnken效应面法工艺优化

以巯基壳聚糖(TCS)为基因载体,采用离子交联法制备能用于基因口服研究的质粒DNA-巯基壳聚糖纳米粒(pDNA-TCS-NPs).分别以TCS质量浓度、三聚磷酸钠(TPP)质量浓度、pH值和转速为考察对象,以pDNA-TCS-NPs粒径和Zeta电位为评价指标,采用4因素3水平Box-Behnken 效应面法筛选最佳制备工艺,并对其外观形态,包封率等体外性质进行考察.结果表明:TCS质量浓度为0.80 mg·mL^-1,TPP质量浓度为0.65 mg·mL^-1,pH=5.3,转速为2 000 r·min^-1是最优制备工艺,可制得粒径为(134.21±1.34)nm,Zeta电位为(24.36±0.29)mV,包封率在(80.26±0.56)%,形状规则且分散良好的pDNA-巯基壳聚糖纳米粒;Box-Behnken 实验设计可用于预测和优化pDNA-TCS-NP制备工艺优化筛选.     

一种特殊的DNA拓扑结构形式

透射电子显微镜研究表明,质粒ｐＢＲ３２２ＤＮＡ分子中有一定特殊的拓扑结构因子,这种拓扑结构因子能阻止超螺旋扭力在整个分子内的传递。细胞内的巨大染色体ＤＮＡ可能被这种结构分隔成较小的环。     

红细胞生成素(EPO)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中稳定表达

将ＥＰＯｃＤＮＡ分别插入真核表达质粒载体ｐＳＶ２ｄｈｆｒ和ｐｃＤＮＡ３的适当位点,用电脉冲法导入ＣＨＯ细胞,用ＥＬＩＳＡ法检测ＥＰＯ的表达量,用ＴＦ１细胞检测ＥＰＯ表达产物的生物活性．结果表明,用ｐＳＶ２ｄｈｆｒ作为载体,在抗ＭＴＸ阳性细胞克隆中,获得了表达ＥＰＯ（２５８ｎｇ／ｍＬ培养液）的ＣＨＯ细胞株,并且表达产物具有生物活性．进一步的传代和冻存试验表明,所得细胞株表达ＥＰＯ的水平不受传代和冻存的影响     

三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.