抗稻瘟病水稻BAC文库的构建与鉴定

水稻是一种重要的粮食作物，同时也是一种重要的单子叶植物模式.稻瘟病是水稻生长中的一种严重病害，因此分离和克隆新的稻瘟病抗病基因具有重要的应用价值.以一个抗稻瘟病农家种水稻为材料，以plndigoBAC5为载体，构建了细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有90 000个转化子，插入频率99％，插入片段平均长度为105 kb，由此推测这个文库覆盖水稻基因组约20倍.利用其中的45 000个转化子建立了4维PCR筛选体系，并且通过4维PCR筛选体系，筛选获得了7个含水稻分蘖基因（MOC1）的阳性克隆.因此该文库是一个高质量、高覆盖率的水稻BAC文库，能有效用于目的基因的分离.     

水稻S_5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料 ,构建了一个覆盖 9倍核基因组的cosmid文库 ,其平均插入片段约4 0kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC2 3D12的R末端为探针 ,从cosmid文库中筛选得到一个阳性克隆R2I19(～ 32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱 ,初步确定为S5区候选克隆。对该克隆的 2个TAC亚克隆TRW15 10 (～ 15kb)及TRW15 17(～ 15kb)进行了初步的生物信息学分析 ,证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性 ,并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

水稻S5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料，构建了一个覆盖9倍核基因组的cosmid库，其平均插入片段约40kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC23D12的R末端为探针，从cosmid库中筛选得到一个阳性克隆R2I19（－32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱，初步确定为S5区侯选克隆。对该克隆的2个TAC亚克隆TRW1510（－15kb)及TRW1517(-15kb)进行了初步的生物信息学分析，证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性，并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

 利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌,其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因,通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造,提高纳他霉素的效价和产量,提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA,用Hind III和Bam HI部分酶解后,回收了97~194kb和48.5~97kb大小的高分子量DNA,与质粒载体Copycontrol pCC1BAC连接,分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆,酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb,空载率小于1%,假定利迪链霉菌的基因组有8×10⁶kb,计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此,从文库筛选到目的片段的概率达99.99%以上。     

Cupriavidus metallidurans CH34中2个苯酚降解基因簇的筛选与功能鉴定

Cupriavidus metallidurans(C.metallidurans)CH34是一种重金属耐受性细菌,能在以苯酚、甲苯酚、苯甲酸、苯胺等芳香族化合物为唯一碳源和能源的培养基中生长,其基因组中含有2个苯酚降解基因簇.以载体pIndigo-BAC 5构建C.metallidurans CH34的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库,获得约3万个克隆,平均插入片段大小为30 kb,插入频率为98%,推测该文库覆盖CH34基因组约1 240倍.用PCR筛选文库中的3 000个单克隆,共获得9个阳性克隆,其中5个克隆含有长基因簇,4个含有短基因簇,并从中得到含有全长苯酚降解基因簇的克隆.利用以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基,研究2个基因簇在大肠杆菌中的表达情况.结果显示,两个基因簇均表现出了苯酚降解能力,短簇的降酚能力要优于长簇.     

中国美利奴细毛羊BAC文库的质量评价

从文库的平均插入片段大小、文库的覆盖率、文库克隆的稳定性对中国美利奴细毛羊BAC文库进行了质量评价.统计结果表明,文库的平均插入片段大小约为133kb, 非重组克隆占3.2%,文库在理论上约有8倍绵羊基因组覆盖率,从该文库中找到任意单拷贝序列的概率为99.93%.连续多次传代培养实验证实文库克隆的遗传稳定性好.     

黄瓜SRAP遗传连锁图的构建及始花节位的基因定位

在由黄瓜自交系S06与S52杂交产生的F2群体中,应用SRAP(sequence-related amplified polymorphism)标记构建黄瓜的分子遗传连锁图谱.使用了64个多态性引物组合,共得到108个多态性条带,单对引物组合最多的产生5个多态性条带,平均1.7个.在F2群体中对这些多态性位点进行连锁分析,并用Mapmaker 3.0构建连锁群,77个标记位点进入9个连锁群(LOD≥3.0),总长1114.2 cM,标记平均间距14.5 cM,标记均匀分布于整个连锁群.同时将始花节位性状控制基因ffn(first flower node)定位在第Ⅸ连锁群上,与两侧标记DC1EM5和ME7EM2A的距离分别为10.3和12.1 cM.     

活性污泥宏基因组Fosmid文库的构建

大插入片段宏基因组文库的构建是开发大片段目的基因及分析其结构与功能的基础.文中分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒及琼脂糖包埋法提取活性污泥宏基因组DNA,其中琼脂糖包埋法获得的DNA片段大于23kbp,利用此DNA成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库,该文库含有5280个克隆,平均插入片段长度为35～40 kbp,共包含约200 Mbp的宏基因组DNA.从此文库中随机挑选200个克隆,利用活性筛选方法快速筛选到了1个含有淀粉酶的阳性克隆,表明活性污泥Fosmid文库可用于功能基因的活性筛选,具有开发新基因的潜力.     

盐藻（Dunaliella viridis）细菌人工染色体文库的构建和鉴定

盐藻具有极强的耐盐能力，是研究植物耐盐机制的模式系统.为了对其耐盐机制进行深入的 研究，以pCC1BAC为载体，构建了盐藻的细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有9 216 个转化子，插入片段平均长度为55 kb，以单克隆形式保藏在96块96孔板中，并建立了四维P CR基因筛选体系，可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆.根据本实验室分离到的两个盐 藻基因的cDNA序列（ DvSPT2和DvTPSP ）设计引物，通过PCR从该文库中各筛到4个阳性BA C克 隆，说明该文库能有效用于分离盐藻基因的基因组序列，据此推测该文库约覆盖4倍盐藻基 因组序列.     

与黄瓜耐高温QTL连锁的分子标记分析

耐高温性状对黄瓜的夏季生产具有重要意义.用耐高温自交系863-7和不耐高温自交系863-6构建F2群体.在生长箱中对群体进行高温胁迫处理一个月,测定其相对生长综合值作为耐高温性状值.用62对SSR引物和132对SRAP引物组合对亲本进行多态性筛选,8对SSR引物和71对SRAP引物组合呈现出多态性.对多态性的标记进行群体分组分析和选择性基因型分析,发现1个SSR标记和9个SRAP标记与黄瓜耐高温QTL连锁,对表型的贡献率在6%～17%.Mapmaker分析发现7个标记(CSCT335、ME10EM2-350、ME11EM2-640、ME11OD3-230、DC10D3-150、ME8EM10-590和ME8EM7-590)位于同一连锁群,2个标记(ME1EM6-670和ME9EM6-650)位于另一连锁群,标记ME9EM1-210不与其他标记连锁,它们代表的3个QTL累计的表型贡献率达32.3%.     

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.     

葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘,是昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模式种,本研究目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,将限制性内切酶SfiⅠ消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,转化入大肠杆菌(DH10B),获得原始文库。经过涂平板测定表明,原始文库的库容量为2.3×107个单克隆;随机挑取15个单克隆,通过PCR快速鉴定,插入片段大小在0.4~1.2 kb之间,平均大小在0.9 kb,重组率达100%。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。     

黄瓜侧枝基因(lb)和全雌基因(f)的定位及RAPD遗传图谱的构建

利用侧枝长势强、全雌性黄瓜自交系S06(欧洲温室型)和侧枝长势极弱、强雄性自交系S52(来源于大别山农家品种)的杂交F2代群体,构建了黄瓜的随机扩增多态性DNA(RAPD)分子遗传框架图谱,并定位了侧枝性状基因(lb)和全雌基因(f).图谱中共包括79个RAPD标记,分属9个连锁群,总长度1110.0 cM,平均间距为13.7 cM.侧枝基因(lb)定位在一个大的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-1和OP-M-2-2,与lb的间距分别是9.3 cM和15.9 cM.全雌性基因(f)定位在一个小的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-2和BC151,与f的间距分别是13.8cM和13.6cM.图谱的构建为进一步研究侧枝和全雌性状及黄瓜的其他性状的基因打下了基础.     

水稻第9号染色体DNA文库的构建

运用染色体显微分离技术构建了水稻第９号（Ｋ１０）染色体的ＤＮＡ文库,连接物转化大肠杆菌ＤＨ５α共获得４５０００多个重组克隆．随机选取了１００个重组克隆进行分析,插入序列的大小为８０～５００ｂｐ,平均２１０ｂｐ     

厚壳贻贝足腺cDNA文库的构建及部分EST序列分析

为获得厚壳贻贝足腺组织的EST序列标签以及可能的功能基因序列,以pCMVsport6质粒为载体构建了高质量的厚壳贻贝足腺组织cDNA文库,文库滴度为1.31×107pfu/mL,重组率为98%,平均插入片段为1.3kb.通过对文库部分克隆的序列测定,获得了11个新基因和17个功能基因,其中包括部分与厚壳贻贝足丝相关的基因.厚壳贻足腺组织cD-NA文库的成功构建为将来筛选与厚壳贻贝足丝蛋白相关的新基因,系统研究其黏附机制奠定了基础.     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

水稻染色体的显微分离与克隆

对水稻染色体识别、显微分离与切割、PCR体外扩增和微克隆进行了研究 .利用改进的显微切割装置 ,可以在 1 0 0×油镜下进行染色体分离与微切割 ,不仅解决了水稻染色体的识别和显微分离的困难 ,而且可使染色体特定区微切片段缩小到 7Mb级 ;利用 SUP-PCR可使 fg级水稻染色体 DNA扩增到 μg级 .电泳检测结果表明 ,扩增片断在 80～ 60 0 bp左右 ,经与 p UC1 9连接 ,转化大肠杆菌 DH5a,一次分离的单条水稻染色体可以获得 9×1 0 4克隆 ,一个 7Mb级片段可以获得 3× 1 0 4克隆 ,经分析 ,插入片段大小在 80～ 50 0 bp范围 .该方法为直接从水稻单条染色体或染色体特定区 DNA文库中筛选分子标记奠定了基础 .     

中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选中国美利奴羊与免疫反应相关的的功能基因并研究这些基因的功能,构建了以美利奴羊外周免疫器官的cDNA文库。通过提取总RNA,分离纯化mRNA并以其为模版参照ZAP Express cDNA Synthesis Kit说明书构建cDNA文库。结果表明:该文库初级库容达到了3.28×105pfu,扩增库滴度为3.8×108pfu/mL,重组率为97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之间,平均大小为1.5 kb。该文库的成功构建为后续研究奠定了分子基础。