大黄鱼cyp19a/b基因的克隆与表达分析

克隆得到了调节雌雄激素平衡的大黄鱼cyp19a/b基因,cyp19a基因c DNA全长1805 bp(NCBI登录号:FJ800566),其中开放阅读框1557 bp,编码518个氨基酸;cyp19b基因c DNA全长2268 bp(NCBI登录号:FJ800567),其中开放阅读框1503 bp,编码500个氨基酸.荧光定量PCR分析显示cyp19a基因在性腺中有明显的表达,且在卵巢中的表达量极显著且高于精巢;在肌肉、脑、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官中基本不表达.而cyp19b基因在脑、脾脏和肝脏中有较高表达,在性腺和其他器官中基本不表达.     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR分析不同发育时期意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因c DNA序列全长1 404 bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5 k Da,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR组织表达分析意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因cDNA序列全长1404bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5kDa,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。
     

斜带石斑鱼Frizzled 4基因的克隆及表达分析

利用同源克隆和RACE的方法,从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)卵巢中克隆了Frizzled4(g FZD4)的全长c DNA序列.g FZD4的c DNA序列全长2 033bp,其中开放阅读框1 596bp、编码531个氨基酸.氨基酸序列比对和系统树分析显示,g FZD4的结构十分保守,斜带石斑鱼与鲈形目罗非鱼的亲缘关系最近.RT-PCR分析表明,g FZD4基因在斜带石斑鱼组织中广泛表达,其中脑、肾脏、心脏和腮组织的表达量较高.荧光定量PCR检测结果显示,g FZD4基因的表达水平在胚胎发育的早期较低、在桑葚期显著升高、在囊胚期最高,其后除了肌节形成期外均基本与桑葚期的表达水平相似;g FZD4基因在卵巢发育过程中表达水平较低,而在性逆转的精巢发育过程中表达水平显著升高,表明g FZD4介导的Wnt信号通路在石斑鱼的性逆转过程中可能发挥了重要作用.     

广西部分棘蛙类物种的分子系统学研究

以广西棘蛙类为研究对象,应用PCR方法扩增线粒体168 rRNA基因和Cytb基因的DNA片段,进行DNA序列测定。以虎纹蛙和弹琴水蛙为外群,用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建3种棘蛙的系统发育关系。结果表明：所研究的棘蛙类可分为棘胸蛙居群、棘腹蛙居群和棘侧蛙居群3支,与形态分类结果相同。     

青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

采用Illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆BpPG基因,并对其全长基因进行生物信息学分析; 采用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析; 将B. pyrrocinia JK-SH007接种杨树,利用实时荧光定量PCR方法,分析BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中的差异表达。【结果】BpPG基因全长2 001 bp,编码666个氨基酸,预测蛋白质分子量69.23 ku,理论等电点为8.37; BpPG蛋白有6个蛋白质结合位点,属于Glycosyl hydrolases family 28家族,为亲水性蛋白,不具有信号肽。二级结构主要包括α-螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲,三级结构预测结果与二级结构相符。系统进化分析表明,BpPG与PG(GenBank 序列号WP 034181566.1)具有同源性。实时荧光定量PCR结果显示B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中,不同时期的BpPG基因表达量存在差异。【结论】克隆得到BpPG基因,BpPG基因在进化上是保守的,其极有可能在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中发挥作用。     

暴马桑黄GPS基因克隆及响应茉莉酸甲酯诱导表达研究

【目的】对参与暴马桑黄(Sanghuangporus baumii)三萜合成途径的关键酶牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)基因进行克隆及诱导表达分析，以期深入探究暴马桑黄三萜合成分子机理。【方法】采用PCR扩增技术克隆暴马桑黄GPS基因cDNA全长及启动子，利用生物信息学软件对序列进行分析；采用qRT-PCR技术分析不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对暴马桑黄GPS基因转录水平的影响，并用分光光度计测定不同浓度MeJA诱导下暴马桑黄三萜含量的变化。【结果】将克隆得到的暴马桑黄GPS基因和启动子分别命名为SbGPS和SbGPS启动子。基因分析发现SbGPS基因cDNA序列全长1 617 bp,共编码538个氨基酸，没有信号肽和跨膜结构。SbGPS启动子分析结果显示，除了含有CAAT-box、TATA-box等典型的启动子作用元件，还含有茉莉酸甲酯响应元件。荧光定量分析及三萜含量测定结果表明，SbGPS基因表达和三萜含量均随着MeJA浓度增加而呈现出先上升后下降的趋势，并且二者变化趋势基本一致，呈显著正相关。【结论】通过对SbGPS基因的克隆及诱导表达分析发现，该基因在暴马桑黄三萜生物合成途径中具有...