溶菌酶触发的芽孢杆菌芽孢萌发及其异质性研究

【目的】了解溶菌酶触发芽孢杆菌孢子萌发的异质性及其机制,为认识芽孢(Spore)萌发机制和杀灭芽孢提供参考。【方法】应用拉曼光谱和微分干涉差(DIC)显微镜成像技术高通量分析大量单个Bacillus subtilis(Bs)和B.megaterium(Bm)芽孢经溶菌酶触发的萌发动态。【结果】溶菌酶浓度和温度越高,芽孢萌发越快,孢内CaDPA开始快速释放时间(T_(lag))、快速释放所需时间(ΔT_(release))和芽孢皮层水解所需时间(ΔT_(lys))越短;低于20℃,Bs芽孢萌发的ΔT_(release)值是25℃时的4倍以上。SpoVA蛋白高表达菌株的ΔT_(release)值和普通菌株基本相同,而缺少皮层水解酶的菌株ΔT_(release)值高于普通菌株。95℃处理15min的孢子,其T_(lag)、ΔT_(release)和ΔT_(lys)值是对照的2倍以上。Bs芽孢萌发的异质性明显,不仅表现在芽孢间,也表现在菌株间。Bm芽孢对溶菌酶更敏感,芽孢间的异质性显著低于Bs。【结论】溶菌酶触发的芽孢萌发在物种、菌株和单细胞层面都存在显著的异质性;溶菌酶浓度和温度对芽孢萌发有重大影响;皮层水解酶也可能参与溶菌酶触发的芽孢萌发进程。     

产聚β-羟基丁酸芽孢杆菌的拉曼光谱快速筛选研究

【目的】探索快速筛选产生物塑料聚β-羟基丁酸(PHB)芽孢杆菌的光学手段,以期筛选到以葡萄糖或蔗糖为发酵底物的高产PHB优良菌株。【方法】应用拉曼光镊技术快速收集分离株的单个细胞拉曼光谱,分析其光谱特征。【结果】基于拉曼光谱特征峰可快速辨别细胞类型和细胞PHB含量,菌落细胞的PHB拉曼信号强度与菌株的PHB发酵能力有相关性;从不同土壤样品中分离的菌株,45%以上具有产PHB的能力,其中S-C-2菌株在3%蔗糖下PHB最大产量为5.27g/L,PHB占细胞干重70%;拉曼光谱监测发酵过程显示,不同发酵阶段发酵液的PHB总含量与单个芽孢杆菌细胞1732cm~(-1)峰的平均信号强度线性相关。【结论】拉曼光谱可以简单快速分选产PHB的芽孢杆菌,实时监测PHB发酵进程。     

驱油枯草芽孢杆菌产芽孢条件优化

试验研究了采油微生物枯草芽孢杆菌的芽孢形成及萌发过程。结果表明,最适产芽孢培养基为(g/L):氯化钠5,牛肉膏5,酵母膏2,可溶性淀粉20。最适中间调控pH为9.0,最适中间调控温度为45℃。活菌总数达到1.6×10~9CFU/mL,芽孢数达到2.2×10~8CFU/mL,芽孢率为13.8%。对枯草芽孢杆菌进行3 L发酵罐研究,确定了芽孢形成的最佳搅拌转速为140 r/min,同时确定了芽孢在低转速下也可以萌发。     

酿酒酵母孢子萌发的激光镊子拉曼光谱研究

【目的】在生理状态下利用激光镊子拉曼光谱系统对单个酿酒酵母孢子萌发过程进行实时监测,探讨掩盖在群体平均信息下的个体生命信息。【方法】将葡萄糖溶液加入酿酒酵母孢子悬液中诱导孢子萌发,在孢子萌发过程中每隔30min取样并利用激光镊子拉曼光谱系统测定单个酵母孢子的拉曼光谱。【结果】单细胞实时平均拉曼光谱可显示孢子萌发过程中细胞内生物分子的变化:萌发期内分别归属于DNA、蛋白质的722cm-1,1006cm-1峰的峰高基本不变,随后在生长期上升明显,说明生长期胞内开始大量复制DNA,并合成蛋白质;归属脂类的1751cm-1峰的减弱趋势明显,可能是胞内脂类物质消耗造成的。整个萌发生长过程中,源自葡糖糖和海藻糖的858cm-1,908cm-1,1084cm-1,1118cm-1等峰强度先下降后上升,表明在适宜的生长条件下,海藻糖可能转化为单糖被细胞吸收利用,当营养物质逐渐被消耗时,细胞会再次累积海藻糖以抵抗外界不利条件。【结论】激光镊子拉曼光谱技术可反映胞内生物大分子的活动规律,获知单个酵母孢子萌发过程中物质变化的丰富信息,是探索单个活细胞实时生化变化的有效工具。     

芽孢杆菌BC98-Ⅰ拮抗蛋白性质及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌作用

蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)BC98-I分离自沤肥浸渍液中,对黄瓜枯萎病等多种蔬菜土传病害有较强烈的拮抗能力.其无细胞发酵液经55%硫酸铵盐析后得到的20mg/ml拮抗蛋白粗提液在平皿上对黄瓜枯萎菌的抑菌圈直径达19.3mm.该拮抗蛋白经100℃处理30min后仍能保持97.7%的抑菌活性;作用活性pH范围宽,在pH 1.0～11.0的条件下均有活性;对胰蛋白酶、蛋白酶K稳定;对氯仿不敏感;对紫外线部分敏感.BC98-I拮抗蛋白粗提物对黄瓜枯萎菌孢子萌发和菌丝生长有强烈的抑制作用,主要表现为孢子萌发产生的芽管较对照短,芽管膨大形成大泡囊;菌丝扭曲,形成不规则泡囊,原生质浓缩;细胞壁溶解,内含物外溢.     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

【目的】 已有研究表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NJSZ-13菌株对于马尾松具有促生作用,且菌悬液的促生效果最佳。为了进一步解析和评价该菌对松材线虫的生防机理,在虫液和卵液中加入NJSZ-13菌株,研究该菌株对松材线虫的杀线效果以及对其产卵、卵孵化和繁殖量的影响。【方法】 首先通过离心将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株分成菌悬液、发酵液和发酵滤液,并调配成原液、5、10、100和1 000倍的稀释液,其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×10⁸ cfu/mL,以无菌水和NB培养基为对照。①用浸渍法测定NJSZ-13菌株在24 h和48 h对松材线虫的杀线效果。②挑取10对生长良好的雌雄4龄幼虫于1.5 mL离心管,用NJSZ-13菌株处理24 h后将虫卵从离心管冲洗到35 mm培养皿中,统计各处理的产卵量。③在35 mm小皿中加入1 mL无菌卵液(约含400个卵)和NJSZ-13菌株,统计12、24和36 h的孵化虫数。④将100 μL线虫液(含500条松材线虫)与100 μL NJSZ-13菌株混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中,在25 ℃培养箱培养5 d,用贝尔曼法分离线虫并计数。【结果】 ①NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%,而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。②NJSZ-13菌株原液能极显著地抑制松材线虫产卵,随着稀释倍数的增大,这种抑制作用逐渐减小。③NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵,在12 h时极显著地抑制卵的孵化,在24 h时仍达到显著水平,在36 h时仅发酵液和发酵滤液有显著的抑制作用。100倍稀释液处理12 h时,发酵液和发酵滤液相对于对照有显著差异,其他处理时间点均无显著差异。④NJSZ-13菌株原液和5倍稀释液处理松材线虫,其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。10倍稀释液处理松材线虫时,菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响,而发酵液和发酵滤液与对照有显著差异。【结论】 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液均对松材线虫有杀线作用。其中,发酵液和发酵滤液的杀线效果更显著;NJSZ-13菌株能抑制松材线虫的产卵、卵孵化和繁殖,同样发酵液和发酵滤液的抑制效果较菌悬液明显。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病研究

【目的】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13是1株能杀死松材线虫的松树内生细菌,研究该菌株能否诱导马尾松抗松材线虫病,为进一步开发利用该菌株抗松材线虫病提供理论依据。【方法】通过对2年生马尾松苗根部施用NJSZ-13菌株菌悬液和灭活的菌悬液后4 d再接种松材线虫,以观察不同处理的病情发展。测定该菌诱导处理后4天内和接种松材线虫AMA3虫株后28天内马尾松体内防御相关酶活性的变化。【结果】接种松材线虫后42 d,菌悬液和灭活菌悬液处理诱导马尾松抗松材线虫病的效果达54%和33%,且发病时间延迟。接种NJSZ-13菌株后,马尾松体内丙二醛(MDA)含量减少,过氧化氢酶(CAT)活性降低,而过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均显著高于对照;接种松材线虫后,菌悬液和灭活菌悬液处理的马尾松这5种酶活性明显高于未接种菌株的马尾松苗。总体上,菌悬液处理比灭活菌悬液处理的马尾松防御相关酶活性变化显著。【结论】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株能诱导马尾松抗松材线虫病,并且菌悬液的诱抗效果最佳。     

枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究

【目的】研究比较枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化的最优方法。【方法】以质粒pHCMC04(大小为8089bp)转化突变型枯草芽孢杆菌IA857,分别用电转化法、原生质体法、电击法诱导的原生质体法、Spizizen低盐环境感受态转化法(简称S法)、低盐环境形成饥饿感受态法及其改良方案在其它突变菌株的试验方法(简称C法)进行实验,通过比较优化得出最优转化方法。【结果】采用S法转化枯草芽孢杆菌突变株IA857,质粒加入量为70ng时,转化后直接摇床培养1h转化率最高达到1.2×104 CFU/μg DNA,可以满足枯草芽孢杆菌高效转化的要求。【结论】得出了枯草芽孢杆菌突变株IA857最优转化方法并提出转化枯草芽孢杆菌的基本框架。     

芽孢杆菌BC98-Ι拮抗蛋白性质及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌作用

蜡质芽孢杆菌 (Bacilluscereus)BC98 I分离自沤肥浸渍液中 ,对黄瓜枯萎病等多种蔬菜土传病害有较强烈的拮抗能力。其无细胞发酵液经 5 5 %硫酸铵盐析后得到的 2 0mg ml拮抗蛋白粗提液在平皿上对黄瓜枯萎菌的抑菌圈直径达 19 3mm。该拮抗蛋白经 10 0℃处理 30min后仍能保持 97 7%的抑菌活性 ;作用活性pH范围宽 ,在pH 1 0～11 0的条件下均有活性 ;对胰蛋白酶、蛋白酶K稳定 ;对氯仿不敏感 ;对紫外线部分敏感。BC98 I拮抗蛋白粗提物对黄瓜枯萎菌孢子萌发和菌丝生长有强烈的抑制作用 ,主要表现为孢子萌发产生的芽管较对照短 ,芽管膨大形成大泡囊 ;菌丝扭曲 ,形成不规则泡囊 ,原生质浓缩 ;细胞壁溶解 ,内含物外溢。     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

红盖鳞毛蕨配子体发育及其成精子囊素系统的研究

研究了光照和黑暗条件对红盖鳞毛蕨孢子萌发率的影响,同时研究了红盖鳞毛蕨成精子囊素对其孢子萌发和配子体发育的影响以及红盖鳞毛蕨成精子囊素对水蕨孢子萌发和配子体发育的影响．实验表明：①光照不是红盖鳞毛蕨孢子萌发的必要条件,但能显著促进其萌发;②在光照条件下,红盖鳞毛蕨成精子囊素可促进其孢子萌发和雄配子体发育;在黑暗条件下不能促进其孢子萌发;③红盖鳞毛蕨配子体各发育时期产生的成精子囊素对水蕨孢子萌发和配子体发育均无显著影响．     

网状球囊霉孢子萌发和菌丝生长条件的优化

为了确定AM真菌孢子萌发和菌丝生长的最佳水平条件,采用L16(45)多因子正交实验对影响网状球囊霉孢子萌发和菌丝生长的因素进行了优化选择.结果表明:优组合为A4B2C2D3E3,即pH 8,水琼脂质量浓度10 g/L,培养周期10 d,后熟条件20 d,培养温度28℃为最佳组合.同时发现在优组合下孢子不仅萌发得早,萌发率高,菌丝生长也很旺盛.     

光轴肿足蕨配子体发育及其系统学意义

采用改良Knop′s液体培养基对光轴肿足蕨(Hypodematium hirsutum(D.Don)Ching)的孢子进行培养,观察其孢子萌发和配子体发育过程。结果表明,成熟的孢子深褐色,不透明,两面体型,单裂缝,极面观椭圆形,赤道面观为豆形,周壁褶皱。接种18天后孢子开始萌发,孢子萌发为书带蕨型,播种25天左右发育为3～5个细胞的丝状体,35天左右发育为片状体,50天左右形成幼原叶体,原叶体发育为三叉蕨型。幼原叶体不对称,成熟的原叶体呈对称心形。原叶体边缘及背腹面都具单细胞乳头状的毛状体。播种65天左右开始出现性器官,精子器近圆球形,由3层细胞构成,成熟颈卵器颈部由4～5层细胞构成。光轴肿足蕨的配子体发育特征表现出较为进化的特点。     

云南省玉米灰斑病菌孢子相关生物学特性研究

为探明玉米灰斑病在云南省发病较重的原因,该试验在田间条件下,采用人工喷雾接种玉米灰斑病菌,研究玉米灰斑病潜育期、病斑产孢、孢子飞散以及菌龄、温度、湿度和光照对孢子萌发的影响.结果表明:昆明地区玉米灰斑病在感病品种会单4号上的潜育期为12～13d;病斑产孢量随显症天数的增加呈单峰曲线,显症后24～27d病斑产孢量达到最大值;玉米灰斑病菌孢子主要在夜间飞散,风或雨有助于孢子的飞散与传播;菌龄对孢子萌发影响较大,随菌龄的增长,孢子萌发率降低;在10～30℃时,分生孢子均能萌发,但以22℃最适,35℃以上或4℃时均不能萌发;水滴有利于孢子萌发,光照对孢子萌发影响较小.     

影响AM真菌孢子萌发因素的研究

在离体条件下培养AM真菌孢子,测定不同培养基pH值、成分以及培养温度条件下的孢子萌发率,优化AM真菌孢子的培养环境.结果表明：培养基pH6.0时,孢子萌发率最高,过高或过低都会抑制孢子的萌发.AM真菌在土壤中储存两个月最有利于孢子萌发.培养基中添加人工合成植物激素GR24对孢子萌发率有极显著影响,浓度450 pg/L时,孢子萌发率最高.低浓度的精胺能够增加孢子菌丝的生长点个数,提高孢子的萌发率,含量过高时（＞40 mg/L）抑制孢子的萌发.培养温度30℃较适合AM真菌孢子的萌发,低于或高于30℃孢子萌发率有所下降.本试验结果将为构建AM真菌-毛状根双重培养体系提供适宜的培养条件.     

FAST台址环境对GPS-RTK测量精度的影响及应对措施

FAST（Five-hundred-meter Aperture Spherical radio Telescope,500 m口径球反射面射电望远镜）是我国正在贵州建设的重大科学项目,建成后将成为世界上最大的单口径射电望远镜.其中FAST馈源一次支撑测量精度要求17 mm,将采用GPS-RTK与全站仪两种测量方式,本文主要通过实测数据分析FAST台址洼地环境对GPS-RTK测量精度造成的影响,并根据FAST台址地形图和馈源舱的运行轨迹制定相应的解决方案.     

披针新月蕨的配子体发育及卵发生

采用显微观察技术对披针新月蕨（Pronephrium penangianum）的配子体发育和卵发生进行了研究.结果表明：披针新月蕨孢子褐色，二面型，接种后约12 d，孢子萌发，经丝状体和片状体阶段，发育成原叶体，孢子萌发是书带蕨型（Vittaria-type），原叶体发育是槲蕨型（Drynaria-type），成熟原叶体是心形，接种46 d后产生颈卵器和精子器.披针新月蕨的颈卵器起源于原叶体生长点下方的原始细胞.原始细胞经过2次不等分裂，形成3个细胞，分别是顶细胞、初生细胞和基细胞.其中，初生细胞不等分裂，形成中央细胞和颈沟细胞.随后，中央细胞不等分裂形成腹沟细胞和卵细胞.随着卵细胞成熟，颈沟细胞和腹沟细胞逐渐退化，但腹沟细胞通过孔区与卵细胞相连.卵细胞成熟后，细胞上表面具有明显的卵膜，中央具有受精孔.本研究对于完善蕨类植物生殖生物学和探讨蕨类植物的演化具有重要意义.     

砂仁叶枯病病原菌生物学特性的研究

通过对砂仁叶枯病病原菌(Pestalotiopsis sp.)生物学特性的研究,结果表明适宜的温度能促进菌丝生长和分生孢子萌发.菌丝生长和分生孢子萌发的最适pH值为6;麦芽糖和葡萄糖为菌丝生长的最适碳源;硝酸铵为最适氮源;蔗糖最易促进孢子萌发;通气条件能促进菌丝生长和分生孢子的萌发;连续光照易促进分生孢子产生.无氮源和无碳源条件下菌丝生长不良;相对湿度在95%以下时,分生孢子不萌发.     

生长素及其运输抑制剂对粗梗水蕨孢子萌发的影响

研究了生长素IAA及其运输抑制剂NPA，TIBA，BFA对粗梗水蕨孢子萌发率的影响.抑制剂NPA，TIBA，BFA均抑制孢子萌发，但IAA减弱NPA和TIBA的抑制作用，NPA的抑制及IAA对其的拮抗在不同萌发时期均有体现；生长素及其运输抑制剂在粗梗水蕨中通过影响细胞骨架甚至囊泡运输，损害了孢子萌发中重力感应和细胞核迁移等关键事件.