异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

不同倍性鲤科鱼CyclinB基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼CyclinB基因部分DNA序列．结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼CyclinB基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类CyclinB基因DNA片段序列进行比较分析．结果表明：由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750bp,950bp,720bp和720bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段（1200bp和900bp）,三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段（1200bp,900bp和750bp）,每个DNA片段均含CyclinB基因第2,3内含子和第2,3,4外显子．序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200bp片段同源性分别为99．5％,98．9％,99．5％和88．7％,与母本900bp片段同源性分别为97．5％,94．6％,94．2％和89．99／6,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200bp和900bpCyclinB基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性．而三倍体和五倍体鲫鲂的750bpCyclinB基因片段-9父本同源性分别高达98．6％和98．2％,说明其来自父本团头鲂．在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本CyclinB基因片段序列消除现象．此外,用CyclinB基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由CyclinB基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析．     

Analysis of intron sequence variability of the conservative HMG-box of Sox9 genes in allotetraploids and their original parents

The Sox genes of allotetraploids and their original maternal red crucian carp （Carassius caassius red var.） and original paternal common carp (Cyprinus carpio L.) were detected by PCR with the designed primers based on the conserved HMG-box sequence in different species. Sequencing of Sox genes indicated that two Sox9 genes (Atsox9a and Atsox9b) existed in allotetraploids, while only one Sox9 gene existed in red crucian carp (Rcsox9a) and common carp (Ccsox9b). All of the four Sox9 genes contained an intron in the HMG-box, with the sizes of 413 bp, 703 bp, 401 bp and 714 bp, respectively. Moreover, the introns obeyed the rule of “GT-AG”. A high similarity was observed between introns of Atsox9a and Rcsox9a (94.4%), Atsox9b and Ccsox9b (97.8%). Interestingly, the deduced amino acid sequences of their corresponding exons all shared 100% identity. Thus, introns of the HMG-domain of Sox9s in allotetraploids and their original parents have not only the length polymorphism but also intron variability. Our results provide significant molecular evidence for the origin and evolution of allotetraploids.     

Analysis of intron sequence variability of the conservative HMG-box of Sox9 genes in allotetraploids and their original parents

The Sox genes of allotetraploids and their original maternal red crucian carp (Carassius caassius red var.) and original paternal common carp (Cyprinus carpio L.) were detected by PCR with the designed primers based on the conserved HMG-box sequence in different species. Sequencing of Sox genes indicated that two Sox9 genes (Atsox9a and Atsox9b) existed in allotetraploids, while only one Sox9 gene existed in red crucian carp (Rcsox9a) and common carp (Ccsox9b) . All of the four Sox9 genes contained an intron in the HMG-box. with the sizes of 413 bp, 703 bp, 401 bp and 714 bp, respectively. Moreover, the introns obeyed the rule of "GT-AG" . A high similarity was observed between introns of Atsox9a and Rcsox9a (94.4%), Atsox9b and Ccsox9b (97.8%). Interestingly, the deduced amino acid sequences of their corresponding exons all shared 100% identity. Thus, introns of the HMG-domain of Sox9s in allotetraploids and their original parents have not only the length polymorphism but also intron variability. Our results provide significant molecular evidence for the origin and evolution of allotetraploids.     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACE PCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因(HMG1)mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸.不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明:在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性(99%)高于同父本团头鲂的同源性(97%);三倍体鲫鲂与父母本同源性(95%)低于亲本之间的同源性(98%);在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性(100%)高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性(97%).结果表明:远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础.生物信息学分析表明:HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾.这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生"蛋白-DNA"的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成.另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMG1原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制.     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACEPCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因（HMGj）mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸．不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明：在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97%）;三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）;在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性（97％）．结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础．生物信息学分析表明：HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾．这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生“蛋白-DNA”的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成．另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMGl原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制．     

黑斑蛙Sox基因的PCR扩增

以特异扩增人SRY基因HMG -box保守区的一对引物 ,扩增了黑斑蛙的Sox基因 (SRY -boxgene) .结果表明 ,雌雄黑斑蛙个体均扩增出了两条带 ,大小分别为 4 50bp和 90 0bp ,显示了Sox基因在黑斑蛙雌雄个体间无性别特异性 ,且可能含有内含子 .本文为探讨黑斑蛙的性别决定机制及Sox基因的进化提供了分子资料 .     

异源四倍体鲫鲤群体的形成及四倍体化在脊椎动物进化中的作用

对雌雄两性能育并形成群体的异源四倍体鲫鲤的染色体数目和组型,DNA含量,红细胞大小,生殖腺和配子,胚胎发育,形成机理,外形等方面进行了较全面描述。四倍体鲫鲤经过九代（F3-F11）的四倍体性的繁殖,已形成了一个数目庞大的遗传性状稳定的群体。该四倍体群体在染色体数目、生殖、外形特征等方面都与它们的原始父母本-二倍体湘江野鲤和红鲫有本质的差别。在遗传特性、稳定传代、生育隔离等方面,异源四倍体鲫鲤群体为形成一个新的四倍体新种奠定了基础。新的四倍体鱼群体的形成对脊椎动物的进化理论和它们在生产上的应用都具有重要的意义。     

扬子鳄Sox基因的PCR-SSCP分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对引物,扩增了扬子鳄的Sox基因,并进行了SSCP分析,结果显示扬子鳄Sox基因的扩增片段与人SRY基因扩增片断大小相同,为220bp左右;且雌雄个体间该基因片段的单链迁移率无差异,而与人的有较大差异,本研究为扬子鳄的性别决定机制的探讨及Sox基因的进化保守性分析提供分子资料。     

不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标(红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容)、细胞大小(红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值)及它们的显微结构进行了比较研究,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构.结果表明:在不同倍性鱼中,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高;血红蛋白无显著差异;在细胞大小上,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系;在红细胞的形态方面,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异.同时发现随着倍性的升高红细胞的短径/长径比值减小.在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ,Ⅲ两种类型,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞.对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析.     

鲤鱼中5个Sox基因保守区的克隆和比较

SRY/Sry基因已被公认为是哺乳动物的睾丸决定因子(TestisDeterminingFactor,TDF)基因,它的正确的时空表达是雄性生殖腺形成的关键,即导致哺乳动物胚胎性别决定的开关基因.作为一个大基因家族的首位成员,它的发现诱发了Sox基因家族的研究热潮.Sox基因家族是在动物中发现的一类新的编码转录因子的基因家族,其产物具有一个HMG基序保守区,参与诸如性别决定、骨组织的发育、血细胞生成过程、神经系统的发育、晶状体的发育等多种早期胚胎发育过程.鱼类是脊椎动物中进化地位较低的一类生物,除了个别种类出现了与性别相关的染色体外,绝大多数都无异形性染色体,说明了鱼类正处于性别染色体进化的重要时刻.研究鱼类中的Sox基因对于研究SRY的发生、性别染色体的进化以及性别的决定机制有着重要的意义.本实验利用兼并引物PCR的方法,参照Sox基因的HMG-box区氨基酸序列设计简并引物,对鲤鱼(Cyrinuscarpio)的基因组进行扩增,获得5个新的基因片段.经过在Genbank中进行同源性比较和分析,证明它们是鲤鱼的Sox基因并分别命名为CcSox3、CcSox4、CcSox11、CcSox14、CcSox21.与鲤鱼中的这些Sox基因具有最高同源性的基因分别是OlSox3,同源性为94.03%;CvSox4基因,同源性为88.06%;DrSox11基因,同源性为97.01%;MmSox14和HsSox14基?     

远海梭子蟹Sox9基因序列测序验证与进化分析

采用全长转录组文库结合三代高通量测序的方法得到远海梭子蟹Sox9基因的全长序列，通过引物设计及PCR产物直接测序验证三代测序结果，最终准确地获得Sox9基因序列。对Sox9基因全长序列进行生物信息学及基因进化分析。结果表明该基因CDS基因序列全长1461bp，蛋白质的无规则卷曲、α-螺旋、β-折叠区域分别占58.64%、25.93%、0%。进化树分析结果表明，远海梭子蟹Sox9与三疣梭子蟹的Sox10基因同源性较高，其核酸序列和氨基酸序列的相似性分别为96.24%和98.77%。远海梭子蟹的Sox9基因鉴定和蛋白质结构预测与功能分析，将为该物种遗传资源挖掘与利用分析奠定重要基础。     

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼，该三倍体鲫鱼的体侧扁，近似纺锤形，体色为青灰色，无口须.它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间，并且一些可量比例性状超出亲本范围，体现出杂种特征.第一年养殖结果表明，把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养，三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11.11%.性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后，生殖细胞呈退化现象.与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比，三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点，而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征，这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义.     

生命科学及其相关学科的研究（八）

阐述了含有人凝血因子转基因羊、应用细胞工程及有性杂交法培育异源四倍体鲫鲤鱼、基因对人类思维的作用、转基因植物生产人胰岛素、细胞衰老的决定因素、心肌细胞再生方法及基因工程灭蚊等方面的研究进展。     

鲤IGF2b基因内含子的克隆、基因组序列分析及慢病毒载体构建

 为了了解鲤IGF2b基因与鲤生长性状之间的关系,以建鲤为试验材料,克隆了IGF2b基因内含子,分析其基因组序列的特点,构建了IGF2基因的慢病毒载体,同时观察其在293T细胞中的表达活性。结果获得鲤IGF2b 5 173 bp长度的基因组DNA序列(HM755899),共有3个内含子,4个外显子;在3′非翻译区存在2个CpG岛,在5′端非翻译区存在(T)n重复序列;除此之外,成功构建了慢病毒载体质粒Lenti-IGF2b-IRES-EGFP,转染293T细胞后,产生的重组慢病毒颗粒出现高表达绿色荧光,荧光定量PCR检测发现IGF2b基因在293T细胞中高表达。这些结果将为研究IGF2b基因在多态性、表达方面与鲤生长性状之间的关联奠定基础。     

鲤鱼Xbp1基因克隆与组织特异性表达分析

利用RT-PCR和RACE技术克隆得到鲤鱼(Cyprinus carpio L.)X盒结合蛋白1(Xbp1)基因编码序列全长。生物信息学分析发现,鲤鱼Xbp1 mRNA的26 bp内含子及其两侧序列能形成典型的茎环结构,其蛋白结构具有1个保守的碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域;系统进化分析表明鲤鱼Xbp1与斑马鱼的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR检测结果表明,两种亚型Xbp1 mRNA在鲤鱼不同组织中广泛表达,且未剪接型Xbp1 mRNA的表达量明显高于剪接型。     

鱼类转基因早期胚胎细胞的核移植研究

像许多转基因高等生物一样,用显微注射方法研制的转基因鱼均为转植基因嵌合体,培育纯合转基因品系已成为研究者们向往和追求的目标.以澎泽鲫(Carassius auratus,Pengze var.)和黄河鲤(Cyprinus carpio,Huanghe var.)为实验材料,以转基因囊胚细胞核或原肠胚细胞核为供体,进行了细胞核移植.检测了转植基因在所获得的移核胚胎和5尾澎泽鲫移核鱼及1尾黄河鲤移核鱼中的存在状况,分析了用转基因早期胚胎细胞核移植方法研制纯合转基因鱼的可能性.     

鲤科鱼类系统进化过程中SINEs的插入事件

短散在核重复序列(SINEs)是真核生物基因组内的移动元件,已被广泛应用于系统发育研究。文中报道了用SINE的插入事件和细胞色素b基因来研究鲤科鱼类的进化.结果显示:细胞色素b基因和SINEs插入事件在大的鲤科鱼类分类上都支持形态学的分类结果,将整个鲤科鱼类分为雅罗鱼系和鲃系;两种分子标记所获结果的不同之处在于野鲮亚科的进化地位.SINEs插入事件的分析结果显示该亚科的进化地位比较原始,而细胞色素b序列的结果则显示其相对较晚的进化起源.尽管在该研究中分析的物种较少,但为SINEs在鲤科鱼类插入事件的研究提供了基础.