不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACEPCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因（HMGj）mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸．不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明：在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97%）;三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）;在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性（97％）．结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础．生物信息学分析表明：HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾．这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生“蛋白-DNA”的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成．另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMGl原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制．     

利用ATPase基因研究杂交多倍体鲫鲂线粒体母性遗传

三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂是通过红鲫旱×团头鲂舍亚科间远缘杂交形成的．采用PCR产物直接测序法,测定了5尾三倍体鲫鲂、6尾四倍体鲫鲂和6尾五倍体鲫鲂及其1尾父本团头鲂的线粒体DNA ATPase8和ATPase6基因的全序列,并与所获得的红鲫和外群斑马鱼的同源序列进行比较,同时分析了其碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异．红鲫、团头鲂、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂之间的序列分歧率为0．0％-21．6％,它们与外群斑马鱼之间的序列分歧率为27．0％-28．2％．用MEGA3．1软件中的Maximum parsimony（MP）,Minimum evolution（ME）,Neighbor joining（NJ）和UPGMA程序构建的分子系统树具有相似的拓扑结构．结果表明,人工杂交三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征．研究证明ATPase8和ATPase6基因是杂交多倍体鲫鲂遗传变异研究的一个很好的分子标记．     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACE PCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因(HMG1)mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸.不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明:在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性(99%)高于同父本团头鲂的同源性(97%);三倍体鲫鲂与父母本同源性(95%)低于亲本之间的同源性(98%);在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性(100%)高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性(97%).结果表明:远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础.生物信息学分析表明:HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾.这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生"蛋白-DNA"的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成.另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMG1原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制.     

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析

参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用.     

不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标(红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容)、细胞大小(红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值)及它们的显微结构进行了比较研究,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构.结果表明:在不同倍性鱼中,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高;血红蛋白无显著差异;在细胞大小上,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系;在红细胞的形态方面,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异.同时发现随着倍性的升高红细胞的短径/长径比值减小.在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ,Ⅲ两种类型,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞.对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析.     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

枇杷番茄红素β环化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物番茄红素β环化酶（LYC）基因的保守区序列，设计1对PCR引物，以枇杷基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增长约300bp的DNA片段，克隆人pMD-18T载体，测得该基因片段长312bp，编码102个氨基酸，属于开放阅读框的一部分，不含内含子。在GenBank中进行同源性检索表明该序列与苹果番茄红素β环化酶基因同源性为97％，由此推测这个基因属于枇杷番茄红素β环化酶基因。     

绵羊和山羊抑肌素基因的基因组结构和序列分析

提取文登奶山羊和多赛特绵羊的基因组DNA,依据绵羊、奶牛、猪的抑肌素基因外显子区序列同源性设计并合成PCR引物进行扩增,将所获得的DNA片段克隆进行序列测定.绵羊和山羊内含子I的序列同源性为98.2%,内含子II的序列同源性为98%.内含子II中的重复序列明显多于内含子I.DNA序列的聚类分析结果与生物进化过程吻合,说明内含子II的复杂程度高于内含子I,且进化保守性很强.所测定的序列已在GenBank登录.     

河套蜜瓜ACC氧化酶基因cDNA部分片段的克隆和序列分析

以河套蜜瓜(Cucumis melo L．ev Hetao)成熟果实为材料，用硫氰酸胍法提取总RNA，以oligo(dT)15为引物，反转录合成cDNA，利用一对甜瓜ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-earboxylate oxidase，ACO)基因cDNA的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。获得了预期大小的cDNA片段．将此片段克隆于pUCl9质粒中，进行DNA序列分析．序列分析结果表明该片段为545bp，编码甜瓜ACO的第126至第306个氨基酸．该河套蜜瓜ACO基因cDNA序列与Andes甜瓜、Cantaloup charentais甜瓜和哈密瓜的相应序列进行比较，其核苷酸序列与Andes甜瓜的同源性为99．4％；与Cantaloup charentais甜瓜和哈密瓜的同源性均为99．6％。与其对应的氨基酸序列的同源性均为99．4％．     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

异源四倍体鲫鲤群体的形成及四倍体化在脊椎动物进化中的作用

对雌雄两性能育并形成群体的异源四倍体鲫鲤的染色体数目和组型,DNA含量,红细胞大小,生殖腺和配子,胚胎发育,形成机理,外形等方面进行了较全面描述。四倍体鲫鲤经过九代（F3-F11）的四倍体性的繁殖,已形成了一个数目庞大的遗传性状稳定的群体。该四倍体群体在染色体数目、生殖、外形特征等方面都与它们的原始父母本-二倍体湘江野鲤和红鲫有本质的差别。在遗传特性、稳定传代、生育隔离等方面,异源四倍体鲫鲤群体为形成一个新的四倍体新种奠定了基础。新的四倍体鱼群体的形成对脊椎动物的进化理论和它们在生产上的应用都具有重要的意义。     

灰枣和酸枣叶绿体trnL-trnF基因序列分析

以灰枣和酸枣叶片为材料,用改良的CTAB法提取总DNA,用通用引物对枣叶绿体trnL基因内含子和trnL-trnF间隔区进行PCR扩增,得到了trnL基因内含子和trnL-trnF间隔序列片段,并对trnL-trnF间隔序列片段回收测序,测序结果符合植物叶绿体基因trnL-trnF间隔序列特征,用DNAMAN软件进行同源性分析,结果表明灰枣和酸枣trnL-trnF基因序列同源性为94．78％.枣和酸枣的分类学地位是一个长期争议的问题,初步开展了灰枣和酸枣叶绿体基因序列分析的研究,为研究枣和酸枣分子系统进化提供参考.     

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)Toc33基因编码区的克隆及序列分析

以诸葛菜（Orychophragmus violaceus）新鲜嫩叶为材料提取总DNA，并以其为模板，根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana）Toc33基因的编码序列，设计一对PCR引物，扩增诸葛菜叶 本外膜蛋白转运器构件蛋白基因Toc33，得到两条扩增带，将这两条带分别割胶回收，与T载体连接转化E.coli，筛选重组子并测序，结果表明克隆到的这两个片段分别长1475bp，1573bp，通过同源性比较发现，它们之间的同源性达到88％，这两个片段与拟南芥Toc33基因有较高的同源性，分别命名为OvToc33-1,OvToc33-2。参考拟介Toc33外显子和氨基酸序列，分别确定了所克隆的两信诸葛菜Toc33基因片段的7个外显子和6个内含子，得到了诸葛菜Toc33基因的全编码区序列，并推导了其氨基酸序列，这两个DNA序列与拟南芥Toc33基因编码区的同源性分别高达91.8%和92.4%，说明这一蛋白是高度保守的。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Hsp70基因PCR扩增及序列分析

目的：为获得凡纳滨对虾的热休克蛋白70（Hsp70）基因并分析其基因序列．方法：根据GenBank中斑节对虾（Penaeus monodon）Hsp70基因的cDNA序列,设计引物,对经高盐法提取的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组DNA,采用优化的降落PCR（Touch Downeca）程序,扩增凡纳滨对虾Hsp70基因的全长序列．结果：PCR扩增得到一条长1983bp的目的DNA片段,回收纯化该片段并测定其核酸序列．用DNAman软件分析发现,该核酸序列中不含内含子,编码区全长为1959bp;经BLASTn和BLASTx软件分析发现,该编码区核苷酸序列与斑节对虾、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的Hsp70基因序列的相似性分别为97％和62．2％．根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾的相似性分别为99．9％和92．6％．结论：成功地从凡纳滨对虾基因组DNA中直接扩增出Hsp70基因的全长编码区序列。     

山羊与岩羊间特异RAPD片段分析

在两组40个随机引物中，筛选出16个重复性好的多态引物，对山羊与岩羊闻RAPD片段分析表明，16个引物扩增出67条带，其中54条带表现多态，多态率80．60％，山羊各群体共有条带为23条，山羊和岩羊共有条带为13条，岩羊有4条特异带，不同引物所扩增出的片段在各群体中分布频率不同．岩羊特异RAPD片段，OPA-10724的序列与人类全基因组比较，同源的短序列较多，最太长度为86bp，唯有30bp的长度与绵羊ZFZ基因和牛ZFY基因内含子同源。     

无瓣海桑Sonneratia apertala钙调蛋白基因的克隆及序列分析

用高等植物钙调蛋白的保守序列设计两端引物，以红树植物海桑属无瓣海桑Sonneratia apertala总DNA为模板，扩增出无瓣海桑钙调蛋白基因，并以之构建重建质粒pT-ACaM。经测序分析比对，发现无瓣海桑钙调蛋白基因全长1418bp，其中第1外显子76bp，第2外显子371bp，中间为一946bp的内含子所隔开。编码148氨基酸的蛋白质，其编码区序列与已知的其他高等植物的钙调蛋白基因核苷酸序列同源性高达85％以上。而蛋白质序列同源性达95％以上。     

东北虎Sox3和Sox4基因的保守区序列分析

应用特异于HMG－box区域的兼并引物，以基因组DNA为模板扩增了东北虎的SOX基因，在扩增产物中发现一条220bp的扩增带。经过克隆、序列测定和同源性检索，发现一个基因片段与人、小鼠、鸡和爪蟾Sox3的同源性分别为95％、95％、92％和88％；与人和小鼠SRY基因的同源性分别为75％和73％。因此该片段应当为东北虎的Sox3基因片段，被命名为PtSox3。另一片段与人、小鼠、爪蟾和大鼠Sox4的同源性分别为98％、97％、95％和94％；与人和小鼠SRY基因的同源性分别为56％和54％被命名为PtSox4。     

凡纳滨对虾线粒体DNA COI基因片段序列

以相应引物对凡纳滨对虾（Lito penaeus vannamei）线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（mtDNA CO I）进行PCR扩增，经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序，得到709bp的碱基片段．碱基组成A、C、G、T含量分别为198bp（27．93％）、136bp（19．18％）、129bp（18．19％）、246bp（34．70％）．与果蝇（Drosophilayakuba）的mtDNA CO I全序列比对。经分析发现：本实验获得的凡纳滨对虾mt CO I基因片段序列和Gen Bank上的同种序列（AY264901）都只是基因序列的一部分，二者之间有41bp的重叠并可拼接，拼接后的总长为1515bp．证明本实验条件下获得的mtCO I基因片段确实来自凡纳滨对虾线粒体DNA，且本实验所用引物具有通用性．