HBV C区基因扩增与PCR条件的优化

目的:为提高PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)的特异性和灵敏度,降低成本,对PCR条件进行优化.方法:将HBV特异性基因片段转化到大肠杆菌DH5α中,提取质粒,利用PCR扩增HBV C区基因,对PCR条件中的退火温度、Mg2 浓度进行优化,并比较3种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果:HBV C区基因扩增的最佳退火温度为58℃,最佳Mg2 浓度为1.5mmol/L,Biostar Taq DNA聚合酶扩增到10-6.讨论:对HBV C区基因进行了转化和PCR实验条件的优化,为扩大PCR在乙型肝炎病毒(HBV)检测领域中的应用提供实验依据.     

PCR技术在动植物检疫中的应用

一、PCR技术基本原理多聚酶链式反应,英文缩写为PCR,又称无细胞分子克隆法,是近年发展起来的一种快速的特定DNA片段体外扩增法,即一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法.PCR利用两个寡聚核苷酸杂交对应链目的区域的侧翼上,一连串反应包括模板变性作用、引物退火和由DNA聚合酶酶促退火、引物延伸的周期性重复产生特定片段的指数积聚.该片段的末端由引物的5′末端决定.因为一个周期所合成的引物延伸产物可作为下一个周期的模板,所以靶DNA拷贝数目在每个周期中近似地呈倍数增加.这样,20个PCR周期可得约百万(2~(20))倍扩增.把扩增产物放进电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼能看见扩增特异区段的DNA带.     

细叶石斛的位点特异性PCR鉴别

根据细叶石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS 序列,我们设计了位点特异性PCR鉴别引物 XY-JB01S和XY-JB01X,对细叶石斛进行了成功的DNA分子鉴别.在进行位点特异性鉴别PCR之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃, 只有细叶石斛的模板DNA 能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别细叶石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.     

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

正交试验法优化酰胺酶PCR条件

以Salinispora arenicola的总DNA作为研究材料,将正交实验法应用于聚合酶链式反应(PCR)上,探求4种主要因素(退火温度、退火时间、DMSO、引物量)在3个水平上的最佳使用量,迅速找到最佳PCR条件,为后续一系列实验铺平道路。实验得出10μL反应体系最佳PCR条件为:DMSO 0.6μL;引物0.6μL;退火温度56℃;退火时间20 s。经验证确定该条件能大大提高目标条带扩增量。     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

改进的PCR法克隆带小棒链霉菌cefD基因

以GC含量高达74％的带小棒链霉素（S．clavuligerus）染色体DNA为模板，从引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改善PCR反应体系和扩增条件，成功地克隆得到了异青霉素异构酶的cefD基因。改进后的PCR体系中ψDMSO＝0．05并加入适量的TaqDNA聚合酶，退火温度比常规选选择高一些，从而克服了常规PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间的引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率，也可以广泛应用于高GC含量目的的基因的快速扩增。     

构建重组质粒的二步PCR方法

建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.     

Bst DNA聚合酶的纯化及等温扩增检测体系的构建

Bst DNA聚合酶是等温扩增反应中的一个关键酶,但由于专利限制,目前国内实验室所使用的Bst DNA聚合酶大多需要从国外进口,价格昂贵且长途运输影响酶活性,因此亟需自主生产出Bst DNA聚合酶应用于等温扩增检测技术.通过构建Bst Fragement的原核表达质粒,采用原核蛋白表达系统和His-Tag亲和纯化手段,制备成本低,活性高,特异性强的Bst DNA聚合酶.同时,针对特定的模板,对自制Bst DNA聚合酶的扩增反应进行了进一步优化,用不同的产物鉴定方法对扩增效果进行检测,并最终筛选出该酶最优的扩增反应条件为60 mM K+、30 mM(NH4)2SO4、pH为9.0.最后,验证了Bst DNA聚合酶能用于快速准确检测肺炎支原体、肺炎衣原体,降低了相关病原体核酸检测的成本,为之后核酸检测在基层医疗的更广泛应用提供了条件.