雅致放射毛霉AS3.2778碱性蛋白酶的纯化及水解特性

毛霉蛋白酶可以高效地水解大豆蛋白,而且对蛋白水解物具有良好的脱苦效果.为了开发这一蛋白酶系,采用离子交换、疏水层析及凝胶层析等方法,从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中分离纯化出一蛋白酶组分,并对其水解特性进行了探讨.结果显示：纯化后的蛋白酶是一单体蛋白,其相对分子质量大约为32000;该蛋白酶在55℃、pH8.0-10.0的条件下对大豆蛋白显示出较强的水解能力,其水解效果明显优于商品化的蛋白酶（如木瓜蛋白酶、Alcalase及Protamex）,表明该蛋白酶比以上几种商品化蛋白酶具有更广泛的肽键选择性,对大豆蛋白亲和力更强,在大豆蛋白肽链上有相对较多的酶切位点.     

草鱼胰蛋白酶的分离纯化及性质研究

从草鱼肝胰脏中分离纯化出一种胰蛋白酶．纯化过程包括：硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sephamse离子交换,Sephacryl S-200凝胶过滤和Q-Sepharose离子交换层析．SDS-PAGE显示在分子量约为28．5ku处有单一电泳带,表明该酶已得到高度纯化．以Boc-Leu-Arg-Arg-MCA为底物测得该酶的最适温度为40℃．最适pH值为9．0．丝氨酸蛋白酶抑制剂（Pefabloc SC,PMSF,Benzamidine）对该酶的活力有明显抑制作用．底物特异性实验表明该酶特异性分解精氨酸和赖氨酸残基的C末端,进一步证明纯化蛋白为草鱼胰蛋白酶,其酶学性质与鲤鱼胰蛋白酶相似．     

一种测定大豆蛋白质水解度的简易方法

介绍了一种新的测定大豆蛋白质水解度的方法,G-25色谱层析法。该方法利用快速蛋白纯化系统将大豆蛋白水解多肽溶液进行G-25色谱层析,根据蛋白峰和肽峰面积计算蛋白质的水解度,并与甲醛滴定法进行了比较。结果表明,G-25色谱层析法测定的大豆蛋白水解度略低于甲醛滴定法。该方法快速、简便,可以普遍适用于各种蛋白质水解度的测定。     

米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性

米曲霉碱性蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力和较好的脱苦作用.为了便于大量获得该酶以利于工业上的应用,文中通过RT-PCR克隆获得米曲霉碱性蛋白酶基因,将之转化到毕赤酵母KM71菌株中并成功表达,之后用该酶进行牛胰岛素氧化链B链及大豆和花生蛋白的水解试验.结果显示:在10L发酵罐中诱导表达时,发酵液中重组碱性蛋白酶的酶活达4100U/mL;该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5 ～9.5和50℃,在pH值为6.0 ～10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性;该酶具有广泛的肽键选择性;该酶对大豆和花生蛋白显示出了强于部分商品化蛋白酶的水解能力.以上结果表明:该重组蛋白酶具有较大的开发利用潜力.     

链球菌产磷酸甘油氧化酶的基本特性

介绍了经筛选的链球菌(StreptococcusSP.)产磷酸甘油氧化酶的分离纯化及部分性质的研究.发酵培养液经离心收集菌体,用超声波破碎,40%~75%硫酸铵沉淀法进行粗分级,再通过Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose CL-4B、Chelating Sepharose FF和Sephacryl S-200 HR层析纯化,纯化的磷酸甘油氧化酶在还原、非还原SDS-PAGE中显示单一条蛋白着色带并测得该酶的表观分子质量为67.6 kDa,用HPLC测得其天然状态酶的表观分子质量为     

产蛋白酶菌株Bacillus subtilis GS-1发酵条件优化及蛋白酶水解应用初步研究

 利用Plackett-Burman (PB)试验和相应面优化方法对枯草杆菌GS-1菌株发酵产蛋白酶的条件进行优化,以期获得高活性的蛋白酶发酵液。同时,将发酵所产蛋白酶用于蛋白水解实验,以进一步考察蛋白酶的水解特性。首先,通过PB试验,筛选出3个影响菌株发酵过程中蛋白酶活力的主要因子(氯化铵、初始pH值及培养温度)。其次,通过响应面优化法,进一步探讨各参数之间的相互关系并最终拟合得出发酵产酶活的方程。结果表明,在氯化铵 (3.768 g/L), 初始pH (5.6) 以及培养温度 22.4 ℃的条件下,发酵液中蛋白酶的最高酶活力能达到372.814 U/mL。水解试验结果表明：相对于植物来源的蛋白,该蛋白酶粗提物对于动物来源的蛋白具有较大的水解偏好型。该蛋白酶粗提物对于由谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或精氨酸所组成的化学键有较强的水解偏好性。以上结果表明：该菌株发酵所产的蛋白酶在蛋白水解加工行业中具有潜在的开发应用价值。     

红豆中几丁质酶的纯化与表征

利用硫酸铵沉降、离子交换色谱CM-Sephadex C-50、凝胶过滤色谱Sephadex G-75以及高效液相色谱(HPLC)Poros HS-20,从红豆种子中分离纯化出一种具有抗真菌活性的几丁质酶.SDS-PAGE显示还原与非还原状态下该蛋白分子质量分别为27.7和22.7 kDa,这表明该几丁质酶分子内含有二硫键.该酶比活为14.57 U/mg,最适反应pH为5.4,最适反应温度为50℃.它对棉花枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌与瓜果腐霉病菌等真菌有明显的抑制作用.     

蛋白酶解大豆多肽的理化特性

以大豆蛋白为原料,利用微波加热和碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解大豆蛋白,制备单酶、双酶、三酶联合水解的大豆多肽,用葡聚糖G-50排阻色谱法进行分离检测,确定各级分的分子量分布范围.凝胶层析分析结果表明,三酶联合水解得到的大豆肽相对分子质量分布主要在1 100 u以下,而双酶联合水解则在2 000 u以下,可见三酶联合水解效果优于双酶,更优于单酶.此外,物化特性研究表明,蛋白酶水解使得大豆蛋白溶解性、起泡性及起泡稳定性等大大改变.大豆多肽具有良好的溶解性,在蛋白质的等电点附近,不受pH值的影响,且具有高浓度、低粘度的特点,以及良好的吸湿性、保湿性和热稳定性和强起泡能力.     

海洋细菌Pseudomonas sp.7-11产碱性蛋白酶的研究

本文研究了海洋细菌Pseudomonas sp.7-11产碱性蛋白酶的发酵条件及调控机制，并对该蛋白酶进行了分离纯化，实验结果显示，7－11为好氧菌，具有某些嗜低温的特性，而且适宜在偏碱性的条件下生长并产酶；酪蛋白培养基适合该菌株产酶；K^＋对产酶起关键作用；复合氨基酸对产酶有抑制作用，发酵液经盐析和离子交换层析等得到了两个活性峰，其中一个峰达到电泳纯，因此该菌产生蛋白酶不止一种。     

pH渐变条件下双酶协同水解大豆蛋白

研究了在没有外加碱的pH渐变条件下．用枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2．4L,酶活力2．4AU/g)和黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u／g)双酶协同水解从大豆蛋白制备寡肽(10个氨基酸以下的肽)水解物的可行性．考察了单酶单因素水解条件、双酶加入方式对大豆蛋白降解率和蛋白质水解度的影响,并在此基础上通过正交试验进一步优化出双酶一次性投料方案下水解大豆蛋白的最佳条件：水解温度为60℃．碱性蛋白酶加入量为每g蛋白15μL,酸性蛋白酶加入量为6％,底物浓度为40g／L,水解时间为18h．在上述最佳条件下,大豆蛋白的降解率可达76％,蛋白质的水解度可达26％,水解物中相对分子质量小于1350的寡肽达到了66％．结果表明,在不外加碱的条件下,采用双酶协同水解方法能够显著提高大豆蛋白降解率以及蛋白质水解度．     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。     

木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解制备绿豆多肽

用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶顺序水解的方法制备绿豆多肽: 先对水解体系的pH值、 碱性蛋白酶与绿豆分离蛋白的质量比（E/S比）、 水解温度、 绿豆分离蛋白质量分数进行单因素实验; 再在单因素实验基础上, 采用4因素3水平正交实验设计优化碱性蛋白酶水解条件. 获得最佳水解条件为： 绿豆分离蛋白的质量分数为8%, 水解温度为55 ℃, E/S比为8%, pH=9.0. 在最佳顺序水解条件下, 绿豆分离蛋白的水解度达32.58%.     

酶解制备牦牛乳酪蛋白降血压肽的初步研究

目的:牦牛乳富含酪蛋白,其经酶解制备的降血压肽以安全性高、无副作用等优点已成为乳品开发和高血压防治药物研究的新热点.方法:本实验对从牦牛乳中提取的酪蛋白,依据复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶各自的最适pH及温度采用酶解方法制备降血压肽,并且以ACE抑制活性为指标初步筛选最佳水解酶.结果:五种酶ACE抑制肽抑制率分别为:复合蛋白酶为39.02%,中性蛋白酶为67.48%,碱性蛋白酶为56.10%,木瓜蛋白酶为71.54%,胰蛋白酶为8.94%.结论:说明,在最适pH及温度条件下,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶为制备降血压肽的最佳酶选,这为后续进一步的制备降血压肽实验提供依据.     

Nerve growth factor activity of several immunal related serine proteases

Rabbit was immuned by the previously purified protein with high nerve growth factor (NGF) bioactivity (NGF_like protease) from \%Agkistrodon halys Pallas\% and the antisera were collected. The polyclonal antibodies were tentatively purified and then used as ligands of an affinity column. The \%A.h.Pallas\% crude venom was fractionated by this affinity column and then by Mono Q on fast protein liquid chromatography (FPLC). As a result, fraction Ⅱ and fraction Ⅲ were purified respectively, whose N_terminal amino acid sequences show high homology with the serine proteases in snake venoms, as well as the previous NGF_like protease. However, they possessed different levels of NGF bioactivity. The NGF activity of the previous NGF_like protease is equivalent to that of NGF, while the activity of fraction Ⅱ seems relatively low in contrast to fraction Ⅲ which had no NGF activity.     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

复酶水解鹅血工艺条件的优化

研究了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对鹅血液的水解作用,并分析了酶用量、温度、时间、pH值等因素对鹅血酶水解的影响。结果表明,双酶水解效果较好,确定了其最适宜的酶解条件：中性蛋白酶,酶底物浓度比（E／S）为4000U／g,pH值为7．0,温度为55℃,时间为5h;木瓜蛋白酶,酶底物浓度比（E／S）为6000U／g,pH值为7．5,温度为50℃,时间为4h。     

木瓜蛋白酶的纯化和性质

探讨木瓜蛋白酶的理化性质，对番木瓜未成熟果实乳汁进行真空干燥、（NH4）2SO4沉淀和SP-Sephadex50柱层析，分别得到木瓜蛋白酶的粗酶、清酶和纯化酶，可用于不同的工业用途。同时，对纯化的木瓜蛋白酶进行了分子量、等电点、巯基数目、圆二色性、反应动力学以及N-末端和C-末端氨基酸序列等性质的研究，为该酶的进一步开发提供科学依据。     

盐度、温度和pH对2株海南地衣芽孢杆菌相对蛋白酶活性的影响

采用脱脂牛奶平板法,测定了不同盐度、温度和pH对2株分离白海南热带海水养殖系统的地衣芽孢杆菌（Bacillus lichen@rmis）Pb．WC09001和Pb—WC09002的相对蛋白酶活性的影响．结果表明：随着盐度的增加,2个菌株的相对蛋白酶活性都趋于减弱,当盐度增加到50时,仅Pb-WC09001还存在一定的酶活性,其相对蛋白酶活性为1．56U·mL-1,说明Pb—WC09001对高盐度环境的适应性更强．此外,还测定了在18～38℃（以4℃为梯度差）范围内菌株的相对蛋白酶活性,当在与菌体培养相同的温度下测定培养液的酶活时,Pb-WC09001与Pb—WC09002酶活性最高的温度均为34℃;当在30℃测定2个菌株在不同温度下的培养液酶活时,酶活性最高的培养液所对应的培养温度分别为22℃和30℃,说明这2个菌株在相同温度下可产生不同的蛋白酶,同时,Pb-WC09001在低温环境下的相对酶活性强于Pb-WC09002．在30℃、盐度30、菌体终浓度为2×10^3／mL时,Pb-WC09001在pH8．0、Pb—WC09002在pH7．5时的酶活性最高,相对酶活均为2．74U·mL-1,因此,Pb-WC09001对海水环境（pH8．0—8．4）的适应性更强．     

木瓜蛋白酶的原位固定化及理化性质研究

以氨基载体原位固定化PEG相中的木瓜蛋白酶,获得了高固定化率(95.9%)和酶活回收率(38.9%)的固定化木瓜蛋白酶,解决了双水相分离纯化后成相聚合物和目的蛋白难以分离的问题。固定化木瓜蛋白酶的最适pH在7.0左右,最适温度处于60～70 ℃之间。相比游离木瓜蛋白酶,在广泛的pH区间内(3.0～9.0)固定化酶稳定性都较好,热稳定性也有改善。在4 ℃密闭容器内将固定化木瓜蛋白酶以湿润状态保存可以较好地保留其活性。LH-HA固定化木瓜蛋白酶可以特异性地水解单克隆抗体IgG,制备Fab和Fc片段。