羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物, 应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段, 测序得到了该病毒F1L基因序列, 并与几个参考毒株序列进行比对. 实验结果表明, 羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低, 为96.0％, 与Jilin株同源性最高, 为99.4%. 即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小, 可作为基因工程疫苗的目的基因.     

H5N1亚型禽流感病毒M基因的克隆与分子进化分析

以一株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增M基因全长,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,测序结果表明所克隆的982个核苷酸的片段包含了M1和M2基因的完整阅读框架,通过软件推导M1和M2基因分别编码252和97个氨基酸,将M全长序列与Genbank收录的10株H5N1亚型流感病毒M基因序列进行比较,病毒株之间M基因核苷酸序列同源性为92.3%～99.3%,编码的两个蛋白M1和M2氨基酸序列间同源性分别为为96.0%～98.8%和92.9%～99%,分子进化分析揭示了病毒株间的亲源关系.     

PRRSV福建流行毒株结构蛋白基因之克隆分析

对福建省流行的PRRS病毒FJ-1的结构蛋白基因进行了克隆、测序.FJ-1结构蛋白基因序列长3 188个核苷酸,包含7个开放阅读框(ORF).将FJ-1结构蛋白基因与国内外已发表的18个报道全长结构蛋白基因的PRRSV毒株进行核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,发现:其与17个美洲型毒株核苷酸同源性达到89.7%～92.4%,推定各个ORF编码氨基酸的同源性在85.6%～98.6%之间;而与欧洲型毒株Lelystad核苷酸同源性为54.9%,推定各个ORF编码氨基酸同源性为53.2%～78.2%.遗传进化树分析表明FJ-1与美洲型毒株进化距离近,而与欧洲型毒株进化距离远.从分子水平上证明了福建省流行的PRRS病毒属于美洲型毒株.     

广东地区宫颈癌组织HPV18L1基因的克隆及序列分析

目的:了解广东地区地方株HFV18L1基因结构特点,为HPV感染的检测和基因工程疫苗的研制提供实验基础.方法:采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV18L1基因,克隆人毕赤酵母表达载体pPICZaB,测序并对HPV18L1基因进行序列分析.结果:广东地区分离株与德国标准株在核苷酸序列上有4处不同,其中3处由于核苷酸的改变,其编码的氨基酸也发生相应变化,与标准株的同源性为99.8%.与中国西安地区分离株比较有两处突变点相同.结论:广东地区HPV18L1分离株与德国标准株、中国其他地区分离株之间均存在差异.     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒（NDV）ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析

对NDV HB92株NP基因进行了序列测定和分析．结果显示，NDV HB92株NP基因全长1744个核苷酸，开放阅读框共1470个核苷酸，编码489个氨基酸；与其他10株NDV NP基因核苷酸同源性为88．3％～99．1％，氨基酸同源性为91．0％～98．9％；但HB92株与其亲本株QV4的核苷酸和氨基酸同源性只有90．3％和95．0％，不如与弱毒和中毒株的高；系统进化分析表明，HB92株与弱毒和中毒株的进化关系更近．以上结果表明，HB92株NP基因在序列上已远离无毒株而趋于向弱毒和中毒株进化．     

鸡传染性支气管炎病毒M41及疫苗株H52,H120 S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计了一对引物并以RT—PCR特异性扩增出IBV标准强毒株M41和疫苗株H52,H120的S1基因,基因产物大小为1．62kb,与预期相符,对其测定序列后,同源性比较显示M41株与H52,H120的核苷酸序列的同源性分别为99．2％和97．1％,推导的氨基酸序列的同源性分别为98．3％和95．4％,该结果表明IBV M41与疫苗株H52,H120在S1基因上具有高度的同源性。     

新疆猪瘟病毒分子流行病的研究

采用RT-PCR方法从新疆临床发病猪场采集的病料中扩增了CSFV流行株E2基因的主要抗原位点编码区，测定了15株CSFV的核苷酸序列。应用DNAstar计算机软件对6个地区6个代表株CSFV的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析，结果表明：新疆6株CSFV流行株与猪瘟兔化弱毒株(C株)核苷酸序列的同源性为80．9％～82．8％，氨基酸的同源性为86．2％～88．3％，说明新疆CSFV流行株E2基因发生了部分变异，与疫苗株相比抗原性产生一定的差异。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的扩增与序列分析

为了解凉山地区传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分子特征,利用实验室采集保存的感染IBD的法氏囊提取出总RNA.采用RT-PCR方法对IBDV VP2基因进行扩增,测序后与GenBank中的参考序列进行比对分析.结果表明,试验成功扩增出1 369 bp的VP2基因片段;样品与弱毒株和经典毒株的核苷酸同源性高达98.4%～99.6%;系统发生树表明样品中的IBDV与弱毒株B87亲缘关系最近;样品与弱毒株的氨基酸序列同源性为98.9%～99.1%;样品中的IBDV分子特征完全符合弱毒类型的特征,样品与弱毒株的抗原性基本一致,推测样品中的IBDV应与弱毒株或疫苗毒株同一来源.该毒株与疫苗用毒株亲缘关系最近,且IBDV疫苗多为活疫苗,因此,试验结果说明凉山地区IBDV免疫接种率可能较高,但应该拟定更合理的免疫程序.     

高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中选取8株国内报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株,应用DNAStar软件对其ORF6、ORF7基因序列进行分析,与VR-2332株、LV株、国内及周边国家分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树.结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的ORF6、ORF7核苷酸与VR-2332株的同源性为95.1%-95.4%、93.8%-94.1%,与欧洲型（LV）的同源性为69.4%-69.6%、67.9%-68.5%;ORF6、ORF7推导氨基酸与VR-2332株的同源性为97.7%、94.4%-95.2%,与欧洲型（LV）的同源性为80.0%-80.6%、65.3%-66.1%.系统进化树表明,8株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株仍属于美洲型.说明猪繁殖与呼吸综合征病毒不断变异的现今,ORF6和ORF7基因依然高度保守.     

鹅细小病毒C日v强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

貉源犬瘟热病毒昌黎株的分离鉴定及其H基因序列分析

为了解河北省毛皮动物犬瘟热病毒的流行及遗传变异情况,采用Vero细胞从具有犬瘟热临床症状的貉肺脏样品中分离出一株病毒,经过间接免疫荧光、RT-PCR和动物回归试验等鉴定,分离的病毒为犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV CL14株。对该病毒血凝蛋白H基因进行克隆测序和遗传进化分析表明,CDV CL14分离株属于Asia-1型,为我国的流行毒株,H基因核苷酸及其编码氨基酸序列与我国流行毒株有较高的同源性,其中核苷酸同源性最高的为He B(09)1株和LN-13-1株,同源性同为99.1%,而氨基酸同源性最高的为LN-13-1株,同源性为99.3%。     

一株野生鹧鸪源冠状病毒主要结构基因进化特性分析

从野生禽类鹧鸪的喉气管拭子中分离到1株冠状病毒，命名为Partridge/GD/S14/2003（简写为S14）.通过RT-PCR扩增、克隆测序获得了该毒株的全基因组序列（AY646283），序列经DNAstar分析发现，S14毒株与肾型毒株JX1-99，TJ2-96 S1基因同源性最高，分别达到94.6%和93.4%，并且该毒株的S1基因还和QXIBV，LX4株也存在高度亲缘性，分别达到85%和84.3%，同时对S14 S1基因BLAST时发现只有上述毒株和S14有高度同源.由此推测该鹧鸪分离株S14的进化可能与IBV肾型和腺胃型病毒存在一定关系.序列分析表明，S14毒株与GenBank中注册序列QXIBV，LX4的S2基因同源性最高分别达到97.2%和90.6%，都处于Ⅱ群.M基因系统进化树研究发现，S14处于Ⅲ群，与SAIB20，GD698同源性最高，分别达到90.6%和90.2%；而与其S1，S2基因同源较高的BJ，QXIBV株，M基因的进化关系却较远.N基因同源性和系统进化树分析发现，Ⅰ群毒株可能为H52和Gray株发生重组的结果，Ⅱ群毒株可能为H120和D1466等毒株重组的结果，而S14株处于Ⅲ群，其N基因与QXIBV高度同源，达到95.7%，Ⅳ群为肾型分离株.而与其M基因亲缘性最近的SAIB20，GD698则分处Ⅰ，Ⅳ进化群.     

猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定及其S基因序列分析

为分析山东省2016年上半年猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株变异情况,用Vero细胞从仔猪临床腹泻样品中进行病毒分离,通过细胞病变(CPE)观察、聚合酶链式反应(PCR)方法、免疫荧光(IFA)试验、电镜观察、动物回归试验和测序分析,分离鉴定1株PEDV毒株(SDMY1401株).将该毒株进行S基因序列分析和遗传进化分析,结果表明该毒株为PEDV流行变异株.该毒株S基因核苷酸序列与山东省分离株CH-SDZC-2015和河南省分离株CHHNAY-2015同源性最高为99.4%,与疫苗毒株CV777同源性为94%.遗传进化分析表明该毒株与经典毒株DR13、疫苗毒株CV777及以前国内分离毒株在不同分支.     

鸡新城疫强毒分离株SC01的分子特性及与La Sota和F48E8的交叉保护

对NDV四川分离鸡源强毒株SC01的F基因进行克隆测序,克隆的SC01 F基因片段长1600bp,编码的F蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特征,聚类分析属基因Ⅶe型;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为75.4 %～95.4 %,其中与鹅源毒株JS501Go 的同源性高达95.4%,与F48E8同源性为84.3%,与La Sota 的同源性为82%;La Sota弱毒活疫苗及F48E8灭活疫苗免疫小鸡2周后,对SC01的致死性攻击能提供完全保护.     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列。设计了一对引物并以RT-PCR特异性扩增出IBV H52疫苗株的S1基因，基因产物大小为1．62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与其他标准毒株H120，M4l，BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，H52株与H120，M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为91．1％，96．9％和96．8％，由此可以看出，IBVH52疫苗株与标准毒株在Sl基因上具有高度的同源性。     

广东地区HPV16型L1基因的序列分析及其毕赤酵母表达载体的构建

目的: 分析广东地区人乳头瘤病毒(HPV)16型L1基因结构特点;构建广东分离株HPV16 L1毕赤酵母分泌型表达载体.方法:采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV16 L1基因,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαC,测序并对HPV16 L1基因进行序列分析.结果:成功扩增了广东地区HPV16 L1基因,并构建了其毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1.广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株相比有16处不同,同源性为98.99%,其编码的氨基酸序列有8处发生改变;与中国标准株比较有9处不同,同源性为99.18%,其编码的氨基酸序列有4处发生变化;发现在HPV16 L1基因序列中nt5 649、nt5 652、nt5 654、nt5 657、nt5 692、nt5 693,6个位点存在突变.结论:广东地区HPV16 L1基因序列与德国标准株、中国标准株相比较均存在差异;成功构建广东地区HPV16 L1真核表达载体.     

鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与序列测定

根据GenBank上已发表的鸭瘟病毒TK基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,分别扩增鸭瘟病毒标准强毒株(DPV-F34)和鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株(C-KCE)的TK基因,将它们分别克隆入pBS-T载体,转化TOP10大肠杆菌,对阳性的重组质粒进行序列测定.结果表明:DPV-F34与DPVC-KCE的TK基因长度均为1077bp,编码358个氨基酸,二者的核苷酸与氨基酸组成具有很高的同源性,分别为99.4%和98.9%.     

中国部分地区新城疫病毒的分子流行病学研究

选取1994年以来从中国部分地区分离的8株新城疫病毒（NDV）野外毒株,用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增其F基因重要的功能区片段,同时进行克隆和序列测定,构建NOV的遗传进化树,分析其遗传关系。结果表明：所分离的毒株在分裂位点的氨基酸顺序均相当于NOV的强毒株。通过遗传进化树分析表明8株分离株中有7株为基因Ⅶ型新城疫病毒所引起的新城疫在国内呈流行趋势。