抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

抗HTNV单抗1A8鼠/人嵌合Fab抗体植物表达载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8VLCκ基因或1A8Fd基因的重组质粒中扩增出1A8VLCκ基因及1A8Fd基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点,将其克隆入植物表达载体pCAMBIA2301或pBIl21,构建1A8VLKCκ-pCAMBIA2301和1A8Fd-pBI121。用PCR方法改造酶切位点,继而将含有1A8Fd基因的植物表达框克隆入1A8VLCκ-pCAMBIA2301,构建获得1A8Fab-pCAMBIA2301重组质粒,并导入农杆菌GV3101。为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

布鲁菌保护性抗原基因植物表达载体的构建

根据genbank序列,参照植物偏性密码子,设计合成适合植物表达的布鲁菌rplL基因和omp31基因。将携带植物表达优化序列的rplL基因片段与pBI-121载体相连接构建重组植物表达载体pBI121-rplL;将omp31基因与相应酶切并携带植物表达特征序列的pMD19-T6载体连接获得重组质粒,之后酶切获得携带植物表达优化序列的omp31基因片段,将其克隆入pBI-121载体,从而构建出带有不同目的片段的重组植物表达载体,为下一步检测基因在植物中的表达奠定基础。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

日本脑炎病毒（JEV）prME的克隆及其植物表达载体构建

为研究乙脑亚单位口服疫苗，根据Genbank已发表的日本脑炎病毒（JEV）prME基因序列，设计引物，PCR扩增出5锚含有Kozak box，3端含有SEKDEL编码区的prME，克隆入pMD18-T载体中，经过序列测定后，用SnaBI和BamHI酶切消化将prME克隆入用EcoICRI和BamHI酶切消化的质粒pBI121 CaMV35S启动子和NOS终止子之间形成一个表达盒，再用HindⅢ，EcoRI酶切消化将该表达盒克隆入相同酶切的质粒pCAMBIA1301中，获得含有prME的植物双元表达载体．     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建

二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性，是类黄酮代谢途径中的关键酶，对不同花青素的合成与积累起到决定作用，直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因，OjDFR5,并对该基因的序列进行分析，同时将其与真核表达载体pBI121进行连接，获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础，同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。     

OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载体pBI121,完成重组表达质粒pBI121-OjCHI的构建,同时利用冻融法将重组质粒成功转入农杆菌GV3101。该实验的完成可为下一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定基础。     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.     

烟草反义Mlo基因表达载体的构建

获得烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo,为进行烟草遗传转化,获得该基因表达的缺陷型植株打下基础.从烟草叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到Mlo基因的c DNA,以此为模板设计反义引物,通过PCR扩增出反义Mlo基因,将此反义Mlo基因与T载体连接,测序正确后再将此反义片段与植物表达载体pBI 121连接,构建烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo.经Kan选择筛选出反义重组菌落,碱裂解法小量提取质粒后,用Xba I和Bam HI双酶切后再进行电泳鉴定.结果表明,目的基因已与植物表达载体pBI 121连接成功.成功构建了烟草反义Mlo基因表达载体pBI 121-Mlo.     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

大豆GmNHX3基因克隆及遗传转化载体的构建

利用RACE(rapid amplification of cDNA end)方法, 以大豆叶片提取总的RNA为模板克隆了大豆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Glycine max Na⁺/H⁺ antiporter, GmNHX）基因, 并将其连接到表达载体PBI121中, 构建重组表达载体PBI121 NHX3. 分析结果表明： 该基因的ORF为1 503 bp, 推测编码501个氨基酸. 与所选取的10种植物同类蛋白氨基酸序列进行对比, 一致性为72%～94%, 并具有真核生物单价阳离子(氢离子)反向转运蛋白典型的结构域, 将该基因命名为GmNHX3, GenBank接收号为JN872904. 通过PCR和酶切鉴定, PBI121 NHX3构建成功.     

利用线粒体 DNA Cytb 基因 PCR-RFLP 分析方法鉴别青鱼和草鱼

建立了一种以线粒体细胞色素 b（Cyt b）基因为标靶,应用 PCR -RFLP 技术进行草鱼和青鱼种质鉴定的分析方法。设计一对引物 QYCYT -S 和 QYCTY -A 分别对青鱼和草鱼的 Cyt b 基因进行了 PCR 扩增,并选用 BglⅠ和 EcoRⅡ两种限制性内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果表明,草鱼和青鱼都可以扩增出1111 bp 的条带,两种酶切检验发现,草鱼扩增产物能被 BglⅠ切成247 bp 和864 bp 两个片段,而青鱼的 PCR 产物能被 EcoRⅡ切成140 bp 和971 bp 两个片段,这表明,mtDNA Cyt b 基因 BglⅠ和EcoRⅡ的酶切位点都可作为鉴定青鱼和草鱼的有效分子标记。利用 PCR -RFLP 分析 mtDNA Cyt b 基因的方法操作简单,是一种快速鉴别草鱼和青鱼的可靠方法。     

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。     

Function of resveratrol derived from transgenic plant expressing resveratrol synthase gene

Two genes from grapevine coding for resveratrol synthase, named RS1 and RS2, were cloned by RT-PCR. AnEscherichia coli expression vector was constructed by insertion of RS1 into pBV221. A specific protein with the same molecular weight (42 ku) as the resveratrol synthase was expressed and used to prepare the rabbit antiserum. A plant expression vector was constructed by inserting the RS1 gene into pBin438 downstream of the doubled CaMV 35S promoter and TMV-Ω fragment. PCR-positive transgenic tobacco plants were obtained after transformation withAgrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring the plant expression vector. Southern blot analysis demonstrated that the foreign gene was integrated into the tobacco genome. The results of RT-PCR and Western blot indicated that the RS1 gene was transcribed and expressed. Formation of resveratrol in transgenic tobacco was further determined by thin-layer chromatography of silica gel and HPLC. Increased accumulation of human breast adenocarcinoma cells in G₀ and G₁ phases of cell cycle was observed in cells treated with resveratrol purified from transgenic tobacco as compared to the untreated cells.     

人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建

从人单核细胞中提取总RNA,利用RT－PCR方法构建cDNA—mRNA杂交链,然后用人白介素－2基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定．鉴定正确后用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确．结果表明,插入列T载体和pET28a载体中的序列为402 bp的不带信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的IL-2序列相一致,故从人单核细胞中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人IL-2基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒，为进一步开展此病毒分子生物学研究和分子生物学诊断技术的建立创造了条件     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.