用细胞核移植的方法研究黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)早期内胚层细胞核的分化

本研究以移植细胞核的方法,探讨黑眶蟾蜍胚胎发育过程中胚胎层细胞核的早期分化。以囊胚期动物半球细胞核的移植为对照:当原肠早期囊胚腔底内胚层细胞核,与原肠晚期原肠腔底内胚层细胞核,移入去核的未受精卵后;移核卵发育到各期胚胎的百分率,与对照组基本相似。这表明以上两个时期的内胚层细胞核与囊胚期动物半球的细胞核一样,是尚未分化的,它们仍有发育的全能性。在以神经板期内胚层细胞核为供体的移植过程中,虽有一半以上的全囊胚发育到原肠期,但是胚胎进一步发育的能力受到较明显的阻抑。由此得出结论:黑眶蟾蜍内胚层细胞核从神经期开始,出现了较明显的分化,使卵子发育到游泳蝌蚪的能力显著下降。这结果表明黑眶蟾蜍内胚层细胞核的功能变化迟于豹蛙,而与非洲爪蟾相似。     

花背蟾蜍体外跌卵及采用跌卵作为细胞核移植受体的尝试

采用体外跌卵的方法，对花背蟾蜍卵子的体外成熟过程进行了形态学及细胞学检查，并对利用体外跌卵作为细胞核移植受体进行了初步的尝试．结果表明，体外跌卵与活体卵子的离巢及成熟过程基本一致；采用体外跌卵作为移核受体，得到了发育至游泳期的蝌蚪，但发育的百分比低于对照组．     

小鼠体细胞核移植及ES细胞样集落分离

利用小鼠皮肤成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植并从重构胚中分离胚胎干细胞(ES)样集落,以便对体细胞核移植重构胚来源的ES细胞样集落进行研究.结果显示,小鼠皮肤成纤维细胞作为核供体,核移植重构胚激活率为60.48%(254/420),囊胚发育率为6.90%(29/420),6个囊胚中分离出ES细胞样集落,分离率为1.43%(6/420),3个ES细胞样集落能够稳定传代,至第5代时核型正常率分别为77.84%,75.18%,77.20%.分离出的ES细胞样集落具有岛屿状团状隆起结构,碱性磷酸酶染色呈阳性,体外可自发分化成上皮样或梭形细胞.实验证实小鼠唇部皮肤成纤维细胞能够支持体细胞核移植重构胚发育至囊胚,并能分离出可以稳定传代的ES细胞样集落.     

猪卵核移植的研究

以湖北白猪为受体，杜洛克为供体进行了猪卵核移植的研究。结果表明，半胱氨酸对卵具有保护作用。卵龄对核移植效率有显影响，以４２－４８ｈ为宜，激活后卵母细胞做受体可提高移核胚的发育率；供体核发育期对移核胚的发育有显影响。核移植后的重组胚移入受体后，经体内发育得到了５只核移植仔猪。     

绵羊体外成熟,体外受精卵的体外发育及移植后的产羔

体外成熟、体外受精后的绵羊卵在体外长期培养或在2～4细胞期和桑堪～囊胚期移植给受体母羊,观察了培养卵的发育和移植后的受胎率。方法是将采自屠宰场的绵羊卵巢在1～12小时内带回实验室,抽取卵母细胞。从中选取卵丘细胞层完整的卵子,在二氧化碳培养箱内,用含有10％NSS(或FCS)、hCG和E_2,并以Hepes缓冲的M199培养24～26小时。再用以IonophoreA23187诱导获能处理过的新鲜公羊精于进行体外受精.7～10小时后移入发育培养基,即含有10％FCS(或NSS)和丙酮酸钠的Hepes缓冲的M199内继续培养,受精后将部分发育为2～4细胞胚和桑堪～囊胚期胚手术移植给受体母羊。另一部分卵子则在受精后48～72小时的不同时间内统计其卵裂卵的出现率,并继续培养7～12天详细观察卵裂卵的发育情况。在受精后48～72小时卵裂卵的出现率,FCS和NSS组分别为39.6％145/366)和52.4％(182/347),前者显著低于后者;将61枚2～4细胞期胚和桑椹～囊胚期胚分别移植给20只受体母羊,有10只受胎。共产羔11只,受胎率为50％;在发育培养液内继续培养的482枚卵裂卵中有312枚(64.7％)发育为桑椹～囊胚期胚(其中包括部分孵化囊胚)。     

利用体细胞核移植技术生产黄牛和水牛同种、异种转基因克隆囊胚

以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植,结果发现：阿菲迪霉素可有效将胎儿成纤维细胞同步于G0／G1期;以GFP阳性细胞进行核移植,其卵裂率、囊胚率与对照组间无显著差异（P〉0．05）,所构建的重组胚,2-细胞阶段观察不到GFP的表达,4-细胞以后GFP的表达逐渐增强,在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达,将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植,获得1例妊娠;黄牛卵母细胞-水牛供核细胞构建异种重组胚囊胚率显著高于黄牛供核细胞-水牛卵母细胞构建的异种重组胚（P〈0．05）,并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达,GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记．     

成纤维细胞和ES细胞在小鼠和兔去核卵母细胞内发育

以昆明白小鼠成纤维细胞和胚胎干（ES）细胞作为供核细胞，以昆明白小鼠和日本大耳白兔的MⅡ期去核卵母细胞作为受体，采用核移植方法，构楚了克隆胚胎．在同种克隆中，以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率明显低于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（24．4％相对于56．9％，P〈0．05），1．8％的ES细胞克隆胚胎发育到囊胚阶段，而成纤维细胞克隆胚胎没能发育到囊胚阶段；在异种克隆中，以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（89．6％）和囊胚发育率（18．8％）明显高于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（54．2％）和囊胚发育率（4．2％）．     

花背蟾蜍早期发育中内胚层细胞核的分化

以细胞核移植的方法,探讨花背蟾蜍早期发育中内胚层细胞核的分化。实验按供体胚胎的不同发育时期分7组,并以囊胚期动物极区细胞核的移植作对照。结果表明:原肠晚期以前的内胚层细胞核与囊胚期动物极区细胞核一样,是尚未分化的,它们仍具有发育的全能性。从神经胚期开始,细胞核有了明显的分化,但这种分化是渐进的,至摄食期的蝌蚪仍有部分细胞核保持着促使卵子发育的功能。     

不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响

比较了不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响．结果表明：体外培养2-5,6—10,11—15,16v20代的供核细胞的融合率和卵裂率没有差异,但随着体外培养代数的增加,重构卵发育到囊胚的比例下降．16—20代供核细胞组的囊胚率显著低于2—5和6—10代供核细胞组的囊胚率（分别为19．61％,26．67％和28．57％,P〈0．05）;来源于原代牛（G0）,克隆一代牛（G1）和克隆二代牛（G2）的供核细胞的融合率,卵裂率和囊胚率没有明显差异;对于新鲜供核细胞和冷冻供核细胞,胞质内注射法的重构卵率要明显高于透明带下注射法的重构卵率（分别为81．31％,67．96％和82．08％,52．94％,P〈0．05）,但各组重构卵的卵裂率和囊胚率没有差异,冷冻供核细胞结合胞质内注射法可以获得较好的核移植胚胎发育．     

完全体外化牛细胞核移植的研究

本研究探讨了用体外成熟卵母细胞和体外受精胚胎进行核移植的可能性。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。从屠宰场回收的卵巢中抽取卵球－卵母细胞复合体，采用以前报道的方法（石德顺等，广西农业大学学报’１９９４：１３：１－５）进行体外成熟（ＩＶＭ）和体外受精（ＩＶＦ），获得ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎，体外成熟２３－２４ｈ后，在含０．１％透明质酸酶的无钙镁ＰＢＳ（ＰＢＳ）内，用细管反复吹打去掉卵丘细胞。选择具有明显第一极体的卵母细胞通过显微操作移去第一极体及其附近约一半的细胞质进行去核，去核的卵细胞在成熟液内继续培养到ＩＶＭ３０ｈ．体外发育到８－３２细胞期的ＩＶＦ胚胎用作核供体．供体胚胎用含０．２５％Ｐｒｏｎａｓｅ（溶于ＰＢＳ￣－）溶解透明带，并用细管吹打将其分散成单个卵裂球，在ＩＶＭ３０ｈ将单个卵裂球显微注入去核卵母细胞的卵周隙内，并在ＩＶＭ３１ｈ用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲（间隔１秒）来诱导卵裂球与去核卵母细胞的融合。融合卵在颗粒细胞单层培养滴内共培养，体外培养２４ｈ后观察卵裂结果，经体外培养５－８天后发育到桑椹和囊胚的核移植胚胎移植到同期发情的受体．２个月后直检妊娠情况．本实验中共操作１９４枚卵母细胞，     

实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎

目的比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响。方法利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株。然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率。结果胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3%vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05)。结论通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚。     

移植不同发育时期的黑眶蟾蜍细胞核到成熟卵后其早期DNA合成的研究

本研究采用细胞核移植技术及同位素标记法测定不同发育时期的胚胎细胞核移入经针刺激活的成熟黑眶蟾蜍的卵中后,测定其早期胚胎DNA合成的情况。结果表明其第一次DNA合成的高峰期具有随供核胚胎发育时间的增加而推迟出现的趋势。据此说明分化程度越高的细胞核移入成熟的卵子后,在卵细胞质中进行调整和适应所需的时间越长。     

LiCl致畸的蟾蜍胚胎发育早期外胚层细胞核超微结构观察

花背蟾蜍Bufo raddei胚胎发育早期,原肠期外胚层细胞核内含有大量凝聚状的异染色质块。神经板形成后,神经外胚层细胞核内染色质多呈分散状态,到较晚阶段,细胞核内有一部分染色质又由分散状态转变为凝聚状态,利用LiCl在囊胚中期前处理,可产生明显的胚胎背前部化发育,这样的胚胎其外胚层细胞核内染色质的超微变化与未处理胚胎的一致。     

外阴硬化苔藓基底细胞核DNA含量分析

运用图像分析技术，通过Feulgen染色检测外阴硬化性苔藓组织及正常外阴皮肤组织角朊细胞基底细胞核积分光密度、DNA含量。结果显示，与外阴正常皮肤组织比较，硬化性苔藓组织的角朊细胞基底细胞核和分光密度、DNA含量明显降低，差异有显著性（P＜0．05），硬化性苔藓组织的角朊细胞基底细胞核增生能力较正常皮肤低下。     

海嘧啶对人胃癌BGC-823细胞形态、细胞核DNA及细胞间通讯的影响

目的研究海嘧啶对人胃癌细胞BGC-283细胞形态、细胞核DNA及细胞间通讯的影响。方法采用激光扫描共聚焦技术观察海嘧啶对人胃癌细胞及细胞核DNA的影响。采用划痕标记染料示踪技术观察海嘧啶对细胞间通讯的影响。结果海嘧啶可改变细胞形态,使细胞DNA缺损,可促进肿瘤细胞间通讯的恢复。结论通过影响细胞DNA和恢复细胞间通讯是海嘧啶抗肿瘤的作用机理。     

EC109细胞株细胞周期DNA代谢和形态改变的研究

人食管癌细胞株 EC109以显微分光光度计测定癌细胞核 DNA 含量,以放射自显影测定细胞核摄取~3H-TdR 和扫描电镜检查细胞表面的超微结构.大多数 EC109瘤细胞间期细胞核的 DNA 含量增加,主要干系细胞 DNA 含量为2 C,属 G_1期,也可见低于四倍体(3 C),高于四倍体(>4 C).甚至多倍体(>8 C)的瘤细胞.~3H-TdR 加入培养基10分钟后,许多瘤细胞核有银粒出现(S 期细胞).大量细胞进入细胞周期反映其恶性程度高.扫描电镜可见 EC109在细胞周期不同阶段其细胞大小形状和微绒毛也不同.本文结果说明用细胞核 DAN 含量测定,~3H-TdR 掺入和细胞表面超微结构可测定肿瘤周期.也可用这些方法判定瘤细胞的恶性程度.     

"两步法"体外培养山羊卵母细胞的初步研究

体外成熟培养的卵母细胞经本外受精后，囊胚发育率远低于体内成熟卵母细胞，原因之一是由于体外成熟卵母细胞的不充分获能造成的，有假说认为：卵母细胞在体外培养过程中，如果延长GV期，可促进卵母细胞进一步获能，从而提高发育潜能。本文以山羊卵子为研究对象，探讨了山羊卵泡各种成分以及异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制以及抑制解除后减数分裂的影响，结果显示，山羊50％Q卵泡液、100％卵泡液、半卵泡、打孔整体卵泡以及完整卵泡对山羊卵母细胞的核成熟抑制率分别为：0.00%、9.38%、60.47％、78.26%和70.09%，随后，对经山羊半卵泡、打孔整体卵泡、完整卵泡抑制培养后的卵子进行恢复培养发现，卵子核成熟率分别为：64.29%、3.49%和4.13%，山卵母细胞与半卵泡共培养24h后进行0h、12h、20h、24h和30h的恢复培养，核成率分别为：0.00%、20.00%、61.90%、64.29%和43.75%，表明山羊半卵泡可以有效抑制山羊卵母细胞使之处于GV期，并且这种抑制作用可以恢复，恢复培养时间以20h和24h较为适宜，初步研究异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制的影响发现，50％牛卵泡液、1005牛卵泡液、50％绵羊卵泡液、100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制率分别为3.7%、21.88%、10.00%、58.82%，表明，100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制效果较好。     

烟草薄层培养早期细胞核形态与核DNA含量变化的研究

通过应用ＤＮＡ专一性活体荧光染色剂Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８对烟草茎表皮细胞薄层培养物的细胞核进行活体染色，发现在培养早期，细胞核发生了明显变化，由分化时的一般扁圆形和靠壁的位置逐渐变成圆形和居中的位置；核体积增大；染色质结构由致密变得疏松；而后染色质凝缩，发生无丝分裂；经数次分裂之后，细胞形态较一致，通过单细胞核内ＤＮＡ含量的测定，发现细胞分裂之前，核ＤＮＡ含量不增加；而最初几次分裂之后，含量减     

静电场对小鼠胚胎发育能力的影响

首次报道哺乳动物胚胎经静电场处理后对＂细胞阻滞＂和后期发育能力的影响．结果表明，用静电场处理小鼠体外受精卵和２细胞胚胎时，对克服小鼠＂２细胞阻滞＂无显著影响．处理发育于Ｍ１６＋１００μＭＥＤＴＡ＋输卵管上皮的２细胞胚胎时，显著提高了胚胎的发育能力，最佳处理剂量的囊胚率从４２％提高到６４％，囊胚孵化率从２０％提高到４５％．     

冷冻中甘油对小鼠胚胎保护效果的研究

将小鼠２－细胞、４－细胞、８－细胞以及桑棋期的胚胎快速冷冻,以甘油作低温保护剂,浓度分别为０．５ｍｏｌ／Ｌ,１．５ｍｏｌ／Ｌ,２．５ｍｏｌ／Ｌ,３．５ｍｏｌＬ培养到囊胚阶段。结果表明：随着保护剂浓度的升高,胚胎发育率增加;在囊胚之前,发育程度越高,抗低温的能力越强,胚胎的发育率也就越高,各阶段组发育到囊胚期的胚胎经移植后均能得到正常发育的胎儿。