棉花黄萎病菌酯酶同工酶的初步研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对大丽轮枝菌不同致病性、不同营养亲和群的11个菌系和黑白轮枝菌的2个菌系的酯酶同工酶进行了研究.结果表明,采用酯酶同工酶法可区分黑白轮枝菌与大丽轮枝菌,也可区分棉花黄萎病菌中的落叶型与非落叶型.     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。     

不同抗性棉花品种PR基因响应大丽轮枝菌的表达分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病每年给我国农业生产造成严重经济损失。为了明确不同抗性陆地棉(Gossypium hirsutum)品种中病程相关基因(GhPR基因)响应不同致病型大丽轮枝菌的表达差异,揭示GhPR基因在棉花与大丽轮枝菌互作过程中的免疫反应变化,本研究用寄主来源的棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6以及非寄主来源的落叶型菌株S1和非落叶型菌株V31分别对2个感病棉花品种和1个抗病棉花品种的无菌根系进行诱导处理,检测GhPR基因的表达情况。结果显示,棉花黄萎病菌落叶型菌株V592和非落叶型菌株I6均能诱导3个棉花品种的GhPR基因普遍上调表达;在感病品种军棉1号上,2个菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数相当;在感病品种新陆早1号上,I6菌株诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比V592菌株多;表明在棉花感病品种上,非落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力与落叶型菌株的诱导能力相当,甚至更强。在抗病品种中植棉2号上,落叶型菌株V592诱导GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数及上调表达量均显著高于I6菌株诱导的上调表达量,表明在棉花抗病品种上,落叶型菌株诱导GhPR基因上调表达的能力比非落叶型菌株的诱导能力强。对非寄主来源的2个大丽轮枝菌菌株,非落叶型菌株V31诱导感病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比落叶型菌株S1多,落叶型菌株S1诱导抗病棉花品种GhPR基因达到最大相对表达量的基因个数比非落叶型菌株V31多。结果表明,棉花感病品种的GhPR基因对落叶型和非落叶型大丽轮枝菌侵染均有一定的响应能力,棉花抗病品种的GhPR基因对落叶型菌系侵染具有更强的响应能力。     

GDSL脂肪酶增强棉花对大丽轮枝菌的抗性

大丽轮枝菌是影响棉花生长发育的一种通过土传真菌维管束的病菌,严重影响棉花纤维的产量和品质。为研究棉花GDSL脂肪酶(GDSL lipase,GLIP)在植物响应大丽轮枝菌中的重要功能,本研究利用大丽轮枝菌悬浮液对新陆早42号及其转GhGLIP基因的棉花株系叶片进行处理,分析转GhGLIP棉花株系对大丽轮枝菌的生理生化响应。结果表明,棉花GDSL脂肪酶基因GhGLIP能够响应大丽轮枝菌的刺激,转GhGLIP基因棉花株系可显著抑制大丽轮枝菌导致的叶片细胞死亡。与未处理相比,经大丽轮枝菌处理后的野生型和转基因棉花株系植株的GDSL脂肪酶活力显著增加。同时,转基因棉花株系植株过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化物酶的表达显著提升,说明GhGLIP基因诱导了棉花对大丽轮枝菌的抗性。本研究为棉花抵抗大丽轮枝菌的分子机制解析,及进一步利用基因工程技术培育抗病棉花材料提供了有效参考。     

棉花变黑轮枝菌的鉴定及致病性的测定

自湖北棉区有黄萎病症状的棉叶中分离到能产生厚垣孢子的褐色菌,取2个供试菌株V12和V24,经形态特征、生物学特性和ITS分析,鉴定为变黑轮枝菌(V.nigrescens).对其致病性进行测定,发现其对棉花致病力极弱.推测该菌是一种植物衰老期或植物生长势呈下降趋势时的病原菌,常与大丽轮枝菌混生.     

大丽轮枝菌VDmef2基因抗逆及致病相关性分析

【目的】分析转录因子VDmef2在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中的功能。【方法】通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因重组法获得了VDmef2基因的定点敲除突变体,然后分析了该突变体在不同碳源及逆境条件下的表型以及大丽轮枝菌在MIM培养基上微菌核的形成情况,还分析了大丽轮枝菌对陆地棉(Gossypium hirsutum)的致病力。【结果】大丽轮枝菌转录因子VDmef2定位于细胞核。VDmef2基因突变后,大丽轮枝菌微菌核形成能力降低,同时对H_2O_2更加敏感,也丧失了对陆地棉的致病力。【结论】转录因子VDmef2与大丽轮枝菌微菌核形成、耐氧化及致病力有关。     

棉花黄萎病菌 T-DNA 插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过 ATMT 法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae ) 650 个 T-DNA 插入突变体。利用 hiTAIL-PCR 技术获得 17 株 T-DNA 插入体侧翼基因序列,通过blast 比对分析表明,其中 16 个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株 Vd991 相比,出现黄色菌丝型 2 株,中间菌丝型 6 株;部分突变体在生长速率( 7 株)、产孢量( 14 株)和粗毒素产量( 4 株)上都发生了具有统计学意义的变化(p <0.05 );致病力测定表明, 9 株突变体的致病力较野生型有所降低,在 p <0.05 水平具有统计学意义。
     

不同寄主大丽轮枝菌培养性状的比较及致病力分化的分析

为了明确不同寄主来源大丽轮枝菌培养性状的差异及致病类型的分化,本研究对分离自6个寄主的8个大丽轮枝菌菌株通过PDA培养性状、产孢量和孢子萌发率的测定对其生物学性状进行了比较,对4种碳源和氮源的利用对8个菌株的营养需求进行了分析,并通过致病型和生理小种的分子鉴定及对棉花的致病力,对8个菌株的致病力分化进行了研究。培养性状结果表明:5个菌株形成菌核型菌落,3个菌株形成中间型菌落,且菌株之间的培养性状存在明显差异。产孢量和孢子萌发率的结果显示:红花上的Vnu菌株产孢量和孢子萌发率都明显高于其它菌株,具有最强的繁殖力,而番茄上的Vtr菌株的产孢量最低,马铃薯上的S2菌株的孢子萌发率最低,表明各菌株具有不同的繁殖力。对碳源和氮源的利用表明:各菌株对不同种类的碳源和氮源的利用存在明显差异,其中Vtr菌株对所有供试碳源和氮源的利用能力最好,向日葵上的S1对4种碳源的利用最差,表明菌株之间具有不同的碳氮源需求。致病型和生理小种的分子鉴定表明:Vnu为1号小种,除Vtr之外其他菌株均为2号小种,并且只有鉴定为2号小种的菌株才可以进一步分为落叶型和非落叶型;所有供试菌株均能侵染棉花引起黄萎病,马铃薯上的S2菌株和茄子上的S3菌株对棉花的致病力比棉花黄萎病菌V592强,其他菌株对棉花的致病力明显比V592菌株弱,且发病延迟,表明8个菌株致病力分化明显。     

大丽轮枝菌VDmef2基因抗逆及致病相关性分析

【目的】分析转录因子VDmef2在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中的功能。【方法】通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因重组法获得了VDmef2基因的定点敲除突变体,然后分析了该突变体在不同碳源及逆境条件下的表型以及大丽轮枝菌在MIM培养基上微菌核的形成情况,还分析了大丽轮枝菌对陆地棉(Gossypium hirsutum)的致病力。【结果】大丽轮枝菌转录因子VDmef2定位于细胞核。VDmef2 基因突变后,大丽轮枝菌微菌核形成能力降低,同时对H2O2更加敏感,也丧失了对陆地棉的致病力。【结论】转录因子VDmef2与大丽轮枝菌微菌核形成、耐氧化及致病力有关。
     

大丽轮枝菌拮抗芽孢菌株的分离、鉴定及两株菌抑菌特性研究

从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离到146株芽孢细菌.29株对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)具有拮抗作用的菌株中有9株拮抗性极强.经鉴定,9株拮抗性极强的菌株中有2株属短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),7株与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相近.抑菌特性实验表明:J-02和J-15的抑菌高峰分别出现在衰亡期和稳定期,对pH的耐受范围分别为5~9和7~9;J-02的热稳定性较好,J-15对温度较敏感,但100℃处理后仍有抑菌活性;J-02能够抑制大丽轮枝菌芽管伸长形成菌丝,J-15可导致大丽轮枝菌菌丝畸形,失去产孢能力.盆栽实验表明,J-02和J-15这2株拮抗菌对棉花黄萎病有明显防治作用.综合结果表明J-02和J-15均有作为棉花黄萎病生防菌的潜能.     

大丽轮枝菌响应赤霉素基因差异表达分析

为初步明确大丽轮枝菌响应赤霉素的机理,利用野生型大丽轮枝菌菌株V592为材料,用0. 1μmol·L~(-1)植物来源的GA_3进行处理,3 h后收集样本,利用RNA-Seq技术进行转录组分析,以期筛选和明确大丽轮枝菌响应GA_3的差异表达基因及代谢通路。通过Illumina测序,得到大丽轮枝菌10924条功能基因,其中161个为显著差异表达基因(DEGs),包括70个上调基因,91个下调基因;采用GO、KEGG注释库分别对161个基因进行功能注释,发现主要涉及次级代谢产物合成,丙酮酸代谢、二羧酸代谢,生物合成抗生素和碳代谢等相关通路。本研究为进一步解析大丽轮枝菌响应外源植物激素GA_3分子机制奠定了一定基础。     

新疆黑白轮枝菌与大丽轮枝菌核糖体基因ITS区的克隆和序列分析

采用真菌核糖体基因内转录间隔区域(ITS)通用引物ITS1和ITS4扩增黑白轮枝菌与大丽轮枝菌核糖体基因的ITS,并对PCR产物进行了克隆和序列比较。实验结果表明,黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的ITS区都由541个碱基组成;供试的2个黑白轮枝菌菌株的ITS碱基序列同源性为100%,供试的2个大丽轮枝菌的ITS碱基序列同源性为99.82%,有1个碱基的差别。黑白轮枝菌和大丽轮枝菌核糖体ITS碱基序列同源性为99.40%,供试的黑白轮枝菌与供试的大丽轮枝菌至少有6个碱基的差别,且差异所在区域较集中。     

新疆棉田土壤黄萎病菌致病类型和微菌核定量分析

为了明确新疆棉田土壤中黄萎病菌的致病类型及微菌核密度,本研究经重组巢氏PCR建立了双重巢氏PCR,以落叶型黄萎病菌菌株V592和非落叶型黄萎病菌菌株I6的混合DNA为模板,对其检测特异性和灵敏度进行了分析,检测了新疆棉田208份土壤样品的黄萎病菌致病类型。基于实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)建立Ct值与大丽轮枝菌拷贝数及Ct值与微菌核相关性的标准曲线,获得大丽轮枝菌拷贝数和菌核数的关系,定量测定了棉田土壤中黄萎病菌的种群密度。检测结果显示,双重巢氏PCR可同时检测棉花黄萎病菌的落叶型和非落叶型菌系,灵敏度比普通PCR至少提高了104倍。落叶型菌系占供试土样的98. 6%,非落叶型菌系占供试土样的38. 9%,且非落叶型菌系几乎都与落叶型菌系混合发生,表明落叶型菌系是棉田土壤中的优势致病类型。拷贝数(y)与微菌核(x)之间的线性关系为y=11. 54x。不同地块、不同植棉区土壤带菌量均存在差异,阿克苏棉田土壤中微菌核密度最高,塔城的微菌核密度最低。     

基于全基因组序列的尖孢镰刀菌分泌蛋白预测及其特征分析

尖孢镰刀菌是一种以土壤习居为主要特征的植物病原菌,广泛分布于世界各地,且寄主广泛,能引起豆科、茄科、葫芦科等科100多种植物根腐、茎腐、茎基腐等病害,严重时造成植株萎蔫死亡,严重影响着植物的产量和品质.同时,目前生产上对于该菌的防治多使用甲霜灵·锰锌、多菌灵、百菌清等化学药剂,然而,防治效果不佳,急需开发针对该菌新的作用靶标的药剂.前人已经明确植物病原真菌分泌蛋白在侵染、操控植物等过程中发挥着重要功能,然而,学术界尚未见有关该菌中分泌蛋白的报道.本研究以尖孢镰刀菌菌株(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici 4287)的蛋白序列为基础数据,以分泌蛋白所具有的N-端含有信号肽、不含有跨膜结构域、没有GPI锚定位点、将蛋白分泌在胞外4大特征为依据,利用生物信息学在线分析程序明确该菌中含有778个分泌蛋白,并对上述蛋白开展特征分析,明确上述蛋白的氨基酸长度主要集中在101～400aa、氨基酸组成中以G,T,S,A较多,信号肽长度主要集中在16～21aa、信号肽氨基酸组成中以P,S,A,T,G较多,信号肽切割位点为T-X-T类型.为今后进一步开展尖孢镰刀菌的分泌蛋白功能解析和开发新型药剂靶标提供了重要的理论基础.     

棉花黄萎病菌细胞壁几丁质和壳聚糖构成分析

几丁质和壳聚糖是真菌细胞壁的重要组分,在维持细胞稳定性和寄主互作过程中发挥重要作用。为了分析不同发育阶段大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成,本研究以强致病力菌株V592为研究对象,依托CFW染色和壳聚糖抗体标记技术,对不同发育阶段大丽轮枝菌细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成进行了显微观测。结果表明:大丽轮枝菌细胞壁中几丁质和壳聚糖的构成是一个动态变化的过程,除了分生孢子萌发点细胞壁以外,其它各个阶段的细胞壁中都有几丁质的存在,而壳聚糖主要存在于的分生孢子萌发点位置和芽管细胞壁上,另外侵染结构细胞壁上也存在壳聚糖。本研究对深入了解大丽轮枝菌细胞壁的发育生物学奠定了一定基础。     

不同致病力棉花黄萎病菌乙烯含量及相关基因表达量的测定

为了分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)乙烯合成与致病力的关系,本研究以棉花黄萎病菌落叶型强致病力菌株V592和非落叶型弱致病力菌株V774为研究对象,分别将2个菌株于非诱导查氏培养液中和添加棉花根提取物的诱导查氏培养液中进行培养,对其乙烯含量进行测定,并通过qRT-PCR分析大丽轮枝菌中6个与乙烯合成相关基因的表达量。结果表明:强、弱致病力菌株均能产生乙烯,强致病力菌株产生的乙烯含量明显高于弱致病力菌株,且强致病力菌株合成乙烯的能力受寄主根诱导后明显加强。非诱导条件下4个基因在强、弱致病力菌株中的表达量存在差异;在诱导条件下6个基因在强、弱致病力菌株中的表达量存在明显差异(P0.05)。这些基因的差异表达可能是造成强、弱致病力菌株乙烯含量不同的主要因素。     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)pilO基因的功能研究

细菌性果斑病是全世界范围内瓜类生产中的重要病害,其病原菌是西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli).细菌Tpye-IV菌毛的生物合成及功能由十几个基因参与调控,pilO是其中的一个基因.运用同源重组的方法,构建了西瓜噬酸菌AAC-3菌株Type IV菌毛结构蛋白编码基因pilO的功能缺失突变体菌株ΔpilO,对突变体的生长能力、运动能力、生物薄膜形成能力及致病力等进行了测定,同时对菌体形态进行观察.透射电镜观察结果显示突变体菌株不能形成菌毛.ΔpilO突变体菌株的生长基本不受影响,但是其运动能力显著下降,生物薄膜形成能力降低80%,致病力与野生型菌株相比下降了55%.本研究结果表明pilO基因在病原菌Type IV菌毛形成及其运动性和致病力等方面发挥重要作用.     

马铃薯青枯病(Ralstonia solanacearum)质粒基因组分泌蛋白信号肽初步分析

应用SignalP 3.0,TMHMM 2.0,THUMBUP,big-PI,TargetP 1.01,Lipop 1.0,TatP 1.0等7种软件分别对马铃薯青枯病菌Ralstonia solanacearum GMI1000质粒基因组1 681个氨基酸序列进行预测分析.结果表明,该物种质粒基因组分泌蛋白有85个,占其基因组编码蛋白的5.1%.通过对质粒分泌蛋白切割位点信号肽类型分析后发现具Ⅰ型信号肽的分泌蛋白有73个,Ⅱ型的有12个,所有分泌蛋白中具RR-motif信号肽结构的有3个,且均为Ⅰ型信号肽.质粒分泌蛋白中,59个具可预测功能,26个为未知功能蛋白.已知功能的分泌蛋白主要集中于细胞代谢,细胞调控及转运,细胞膜结构等领域.在质粒分泌蛋白中发现3个Ⅲ型信号肽分泌蛋白,该类蛋白是由hip基因编码产生,在植物及动物病原细菌中相当保守,负责将效应蛋白分子转运到寄主细胞中从而产生致病作用.这些功能是该物种在长期进化过程中与环境中各种因子发生互作,相互适应的结果.     

基于全基因组测序的粘绿木霉Gv29-8中分泌蛋白预测

粘绿木霉Gv29-8作为木霉属中重要的生防菌之一,对该菌分泌蛋白进行预测及其特征进行明确具有重要的理论意义。利用SignalP、ProtComp等预测程序对该菌中12427条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,并对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小及切割位点等性质进行分析。粘绿木霉含有分泌蛋白为377个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。