克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

黑曲霉木聚糖酶基因xynB的克隆及在酿酒酵母中的表达

从黑曲霉(Aspergillus niger)克隆木聚糖酶基因xynB,利用重叠延伸PCR法去除其中的内含子.将该基因与质粒pYES2连接,构建真核表达载体,用醋酸锂化转法导人酿酒酵母(Sacharom yces cerevisiae)INVSC1菌株表达.利用α信号肽替换基因原信号肽,以考察信号肽对表达蛋白分泌的影响.结果获得2株重组菌株,分别为xynB连接原信号肽的pYES2-xynB菌株和xynB连接α信号肽的pYES2-xynB-α菌株.木聚糖酶B成功表达,SDS-PAGE检测到约24kDa目的蛋白质条带.木聚糖酶B最适催化温度为50℃,最适催化pH值为5.0,Mn2+对酶活具有强烈的抑制作用.将α信号肽取代原信号肽使酶活达到最高的诱导时间由72h缩短为48h,但是置换信号肽使最高酶活由7.59U降低为3.97U.     

内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)具有改善胃肠道环境、刺激和加强机体免疫反应、抑制肠道特定肿瘤的发生等生物活性.内切菊粉酶能够水解菊粉获得低聚果糖.为了实现内切菊粉酶的高表达,从无花果曲霉(Aspergillus ficuum ATCC16882)中克隆了内切菊粉酶编码基因INU2,并实现了在毕赤氏酵母中的重组分泌表达,摇瓶表达的酶活力为570.4U/mL.去除内切菊粉酶的内源性信号肽序列后,其重组表达水平显著提高,摇瓶表达的酶活力为1013.8U/mL,提高幅度77.7%.TLC分析表明:毕赤酵母重组表达的内切菊粉酶(不含内源性信号肽序列)能将2%长链菊粉水解为2～3个聚合度的低聚果糖.     

马克斯克鲁维酵母表达系统菊粉酶启动子的改造及活性研究

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为一种食品安全级酵母,具有生长快,生物量高等特点,是一种新型的重组蛋白表达的宿主系统.启动子是供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列,调控着转录的起始过程,直接影响基因的表达水平.本文通过易错PCR技术对马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子Pinu进行两轮突变,以阿魏酸酯酶(Est1E)作为报告基因,经筛选、鉴定获得了5个可以显著提高外源蛋白表达量的突变型启动子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47,报告蛋白Est1E的酶活性是启动子改造前的2.31,2.65,5.01,5.40,5.43倍.随后测试了启动子Pm2X47对外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表达的影响,结果显示这两种酶的表达量均有提高,分别是启动子改造前的3.57倍和4.13倍.上述结果提示,改造后的菊粉酶启动子在提高外源蛋白表达水平方面具有一定的通用性,可作为新型候选表达元件,以提升马克斯克鲁维酵母重组表达外源蛋白的能力.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

玉米赤霉烯酮降解酶在马克斯克鲁维酵母中的表达及高产菌株的诱变筛选

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌属霉菌产生的一种霉菌毒素,常见于霉变的玉米、小麦等谷物中.研究发现,来源于粉红黏帚霉(Gliocladium roseum)的α/β水解酶ZHD101能够断裂ZEN的内酯键,破坏ZEN的毒性.本文利用食品安全级的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)重组分泌表达了ZHD101,发酵液上清中的表达产物具有水解ZEN的活性.利用UV和~(60)Co-γ联合诱变方法,提高了ZHD101在马克斯克鲁维酵母中的表达水平.高效液相色谱(HPLC)分析表明,重组菌株分泌表达的ZHD101酶蛋白既能水解标准品ZEN,又能在较温和的条件下水解发霉玉米样本中的ZEN,结果表明该重组菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101,可应用于发霉玉米的脱毒处理.     

不同启动子调控的两种半纤维素酶分泌表达的比较

为提高耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManB在毕赤酵母GS115中分泌表达的酶活力,选择了3个调控蛋白表达能力较强的启动子P_(FLD1),P_(GAP)和P_(TEF1),以P_(AOX1)为参照,分别在毕赤酵母GS115中进行分泌表达.摇瓶发酵结果表明:P_(FLD1),P_(TEF1),P_(GAP)和P_(AOX1)能有效介导DSB和ManB的分泌,但其胞外酶活相差较大.对于DSB,使用P_(AOX1)时酶活力明显高于P_(FLD1),P_(TEF1)和P_(GAP),最高酶活达846 U/mL;对于ManB,使用P_(FLD1)时酶活力高于P_(AOX1),最高酶活达222 U/mL.故在GS115中分泌表达DSB时选用P_(AOX1),而分泌表达ManB时选用P_(FLD1).     

内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达

头孢菌素C(CPC)酰化酶可用于一步酶法合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。对来自Pseudomonas sp.Strain SE83的高活性CPC酰化酶突变基因进行基于毕赤酵母偏好密码子优化,获得基因SECA。选取毕赤酵母内源信号肽DSE4,构建表达菌G/DSECA,首次在毕赤酵母中分泌了CPC酰化酶。与酿酒酵母α-交配因子前导肽(α-factor)相比,DSE4介导SECA的分泌表达效果更优,其介导SECA表达的胞内、外单位体积酶活分别比α-factor高65%和44%。分别以DSE4和α-factor为信号肽构建β-半乳糖苷酶表达菌G/DSEL与G/MFL,进一步考察DSE4介导异源蛋白的分泌效果,G/DSEL的胞内外单位体积酶活也均高于G/MFL。     

CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫

猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已经逐渐成为我国的主要流行毒株.本研究利用马克斯克鲁维酵母研究了2.1b型CSFV E2蛋白及其截短体mE2(690-916aa)在马克斯克鲁维酵母中的重组表达,发现去除E2蛋白跨膜区域可以显著提高E2蛋白表达水平,mE2的表达量在5L发酵罐中达1.25～2.5g/L.经分子筛纯化,mE2蛋白纯度达90%.纯化的mE2作为抗原蛋白,注射免疫小鼠28d后,可诱导小鼠产生抗CSFV的IgG特异性抗体,表明马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2蛋白具有较好的免疫原性.     

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.     

里氏木霉和黑曲霉产酸性木聚糖酶及酶学特性比较

【目的】对黑曲霉和里氏木霉产酸性木聚糖酶的性能及所产粗酶的酶学特性进行分析比较,尤其是考察pH值为4时木聚糖酶酶活力及稳定性,从而确定潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。【方法】将里氏木霉和黑曲霉接种至培养基进行产酶培养,比较分析两者的酸性木聚糖酶、酸性木糖苷酶的酶活力及酶学特性。【结果】黑曲霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(52.36±2.61)U/mL和(0.57±0.01)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为55℃、5.0,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为75℃、5.0;里氏木霉酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(10.12±0.95)U/mL和(0.32±0.05)U/mL,酸性木聚糖酶最适温度和pH值分别为65℃、6.5,酸性木糖苷酶最适温度和pH值分别为65℃、4.5。黑曲霉和里氏木霉的酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,分别为(5.26±0.21)U/mL、(1.72±0.21)U/mL。【结论】黑曲霉所产酸性木聚糖酶明显比里氏木霉的更优良,是潜在的较为理想的酸性木聚糖酶。     

黑蛋巢菌属和红蛋巢菌属真菌的5种水解酶活性测定

通过测定黑蛋巢菌属9个菌株和红蛋巢菌属6个菌株的几丁质酶、β-1, 3葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和木质素过氧化物酶共5种水解酶活性,为评价和合理利用鸟巢菌资源提供依据。结果表明,所有菌株均具有以上水解酶活性,同一种水解酶的活性在不同菌株之间以及同一菌株的不同水解酶活性差异显著。其中红蛋巢菌134表现出最大的几丁质酶活性,达到122.1 U/mL;黑蛋巢菌24的β-1, 3葡聚糖酶活性最强,达到143.7 U/mL;在25℃下培养,黑蛋巢菌185的纤维素酶活性最高,达到62.3 U/mL,35℃下培养,菌株185的纤维素酶活性也最高,达到了137.6 U/mL,所有菌株的纤维素酶活性在35℃培养4周比25℃培养2周要高;在25℃下培养时,菌株134的木聚糖酶活性最高,达到了464.8 U/mL,35℃培养4周时,菌株185具有最高的木聚糖酶活性,达到了745.6 U/mL,总体上木聚糖酶的活性在35℃培养4周高于25℃培养3周;黑蛋巢菌150表现出最高的木质素过氧化物酶活性,为0.297 U/mL。总体比较,菌株185的复合酶系较发达,有望利用该菌株完成植物秸杆的降解及利用。     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶培养基优化研究

利用响应面法对匍枝根霉液态发酵产木聚糖酶的培养基进行优化研究.采用单因素实验,得到最佳的碳源、氮源、无机盐.采用Plackett-Burman对影响匍枝根霉产木聚糖酶发酵的相关因素进行评价,确定有显著效应的3个因素.采用最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用3因素3水平的Box-Behnken实验进行培养基优化.结果表明,培养基组成:3.9%麦麸玉米芯粉混合碳源,0.35%(NH4)2SO4,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4·7H2O,0.4%CaCl2,0.06%吐温-80,1%微量元素液,装液量为100mL,pH自然,接种量为10%,在30℃,180r/min条件下培养,其木聚糖酶酶活达到最高为101.697U/mL,比优化前木聚糖酶酶活提高了3.5倍.     

产木聚糖酶海洋微生物的筛选与诱变育种

以自制木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从多个海洋来源样品中一共筛到60株有透明圈且形态各异的菌株,摇瓶发酵结果显示,38株具有产木聚糖酶能力,其中B659菌株产酶能力最高,酶活力为525.3 U·m L-1.结合B659菌株的形态特征和16S r DNA序列分析鉴定该菌株属于Bacillus属.对B659菌株进行紫外诱变,筛选得到酶活提高13.9%且稳定遗传的突变菌株G3-17;对G3-17菌株进一步进行微波诱变得到酶活较G3-17菌株高出11.6%且稳定遗传的突变菌株W1-40.对B659菌株和W1-40突变菌株进行发酵试验,72 h时W1-40菌株的酶活力达到645.2 U·m L-1,比B659菌株(517.9 U·m L-1)提高24.6%.     

肉色曲霉产碱性脂肪酶发酵条件的研究

对肉色曲霉产碱性脂肪酶的发酵条件进行优化,摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基组成为（%）：黄豆饼粉2,NH4NO3 0.5,玉米粉1,糊精1,柠檬酸钠0.1,K2HPO4 0.5,FeSO4 0.006,大豆油0.6,吐温-800.5mL,pH 9.0.最适产酶温度为28℃,产酶高峰出现在96小时,最佳装液量为35mL,碱性脂肪酶菌株的酶活可达9.3U/mL.脂肪酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为30℃.     

多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及发酵条件优化

构建多功能淀粉酶OPMA-N和OPMA-G的分泌表达载体pMA5-OPMA-N和pMA5-OPMA-G, 应用枯草杆菌表达系统实现了多功能淀粉酶
OPMA-N与OPMA-G的表达与分泌, 并分别对其发酵工艺进行优化. 实验结果表明: OPMA-N适宜的表达与分泌条件为： 质量分数为1%的MgSO₄、 质量分数为0.3%的尿素和质量分数为0.5%的酵母粉为培养液, pH=6.5, 培养液装液量为16%, 37 ℃发酵培养48 h; OPMA-G的最适分泌表达条件为： 质量分数为1%的NaCl、 质量分数为1%的淀粉和质量分数为0.8%的酵母提取物为培养液, pH=7.0, 培养液装液量为32%, 37 ℃发酵培养36 h; 在上述条件下, OPMA-N和OPMA-G的分泌水平分别为发酵液中总蛋白的45%和58%, 分泌酶的比活力分别为每毫克4.57和4.65酶活力单位.     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.