绵羊KAP1.1基因编码蛋白生物信息学分析

为了探究KAP1.1基因(keratin-associated protein 1-1)潜在的生物学功能,利用分子生物学软件对绵羊KAP1.1基因编码蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,该基因共编码182个氨基酸,为一可溶性不稳定蛋白。分子量为18 788.45 u,等电点为6.03。另预测得知该蛋白含有6个磷酸化位点,无糖基化位点,不含有跨膜区和信号肽,推测其不是一个分泌型蛋白。亚细胞定位绵羊KAP1.1蛋白主要在线粒体和细胞核中发挥生物学功能,二级、三级结构显示,无规则卷曲是构成该蛋白的主要结构元件。物种间同源性分析显示,绵羊KAP1.1蛋白氨基酸组成与牛的相似度最高(85.9%)。     

Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建

为构建Neuritin毕赤酵母分泌表达系统,进一步得到高纯度的具有天然活性的Neuritin蛋白提供实验基础。采用人工合成去除信号肽的neuritin基因并在N端引入His标签序列,两端引入Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,克隆至p PIC9K分泌型表达载体。重组质粒经PCR与测序鉴定正确后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,经MD平板与G418平板筛选阳性重组子,抽提毕赤酵母基因组PCR鉴定重组质粒的插入。结果显示,p PIC9K-neuritin重组质粒经测序鉴定完全正确,电转后成功插入毕赤酵母基因组中。由此可知,成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

甜瓜持绿蛋白的生物信息学分析

采用生物信息学方法,对甜瓜持绿蛋白(stay-green protein,SGR)理化性质、信号肽、前导肽、功能型位点、疏水性和亲水性、跨膜结构域、蛋白质二级结构和三级结构进行预测和分析,并构建系统进化树.结果表明:甜瓜含有4个持绿蛋白家族成员,进化分析发现有2个同源基因对,同源的基因对之间功能上完全冗余,4个蛋白都不具有信号肽和跨膜结构域,属于非分泌型蛋白,推测SGR可能在细胞质基质中发挥功能.采用同源建模法预测其三级结构,并通过拉氏构象图分析准确性和合理性,证明了同源建模的结果相对可靠性.     

中华绒螯蟹内源性白斑综合症病毒基因EjsWSSV的克隆与鉴定(英文)

基于已获得的表达序列标签序列,应用RACE技术从中华绒螯蟹基因组中获得了一个白斑综合症病毒基因(EjsWSSV)的全长cDNA序列,全长为3 864 bp并包含一个3 732 bp的开放阅读框,编码一个138.25 kDa的含1 243个氨基酸的多肽,编码的氨基酸序列包含一个VWA结构域.通过序列比对、序列结构比较和一些生物信息学预测分析,表明EjsWSSV蛋白序列与白斑综合症病毒基因组的ORF16具有高同源性,它不含有信号肽和跨膜区,为非分泌型和α-螺旋型蛋白,可能定位于细胞质.通过PCR检测验证,EjsWSSV基因可能为内源性病毒基因.     

嗜麦芽糖寡氧单胞菌H002的基因组分析及对铀胁迫的转录组响应

为探究嗜麦芽糖寡氧单胞菌H002响应金属铀冲击的分子机制及生物修复铀污染的潜力，本研究从基因组和转录组两个层面进行了分析.基因组测序结果表明，H002基因组大小为5 099 056 bp,预测编码4780个蛋白；与其他6个近缘菌株相比，H002拥有344个独特的编码基因，涉及膜转运、细胞运动和分泌等功能.转录组分析显示，在铀胁迫的早期(1 h),差异基因主要富集于细胞运动、分泌、蛋白质和肽聚糖合成等KEGG途径.部分分泌通道相关基因的表达下调，可降低细胞对铀离子的摄取，进而减轻铀离子对细胞的毒性.在铀胁迫的后期(2 h和4 h),参与铀生物矿化的磷酸酶相关基因和能够提供还原电子的细胞色素c基因的表达上调，能以主动方式降低铀的细胞毒性.     

家蚕血液肽聚糖识别蛋白的鉴定和生物信息学分析

采用双向电泳和质谱技术分析、鉴定了家蚕血液中存在的肽聚糖识别蛋白(PGRP).为了进一步研究该蛋白的结构和功能,采用了生物信息学方法对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、二级结构、三级结构、亚细胞定位和GO功能注释等进行了分析.结果发现,肽聚糖识别蛋白是一种分泌类蛋白,可能具有信号肽.其主要分子功能为肽聚糖受体,在生物学进程中发挥的主要作用为肽聚糖代谢和先天性免疫应答.     

大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1的致病功能

大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的病原菌,其分泌蛋白是侵染寄主的主要作用因子.然而目前尚不清楚分泌型淀粉酶在大丽轮枝菌致病过程中发挥的作用.该研究使用BLASTp搜索到大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1,进而对其功能进行了初步研究.酵母信号肽捕获系统表明VdAmy-1的N端信号肽具有引导蛋白分泌的功能.进一步构建大丽轮枝菌VdAmy-1蛋白编码基因缺失的突变体菌株及其回补菌株,发现突变体菌株对淀粉的利用能力和对棉花的致病性均较野生型明显减弱.以上实验表明VdAmy-1是大丽轮枝菌一个重要的分泌型淀粉酶,在其致病性中起重要作用.     

基于全基因组序列的核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白的预测及特征分析

【目的】充分了解核桃黑斑病菌的侵染机制。【方法】以全基因组序列已经公布的7个核桃细菌性黑斑病菌菌株CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417等所具有的蛋白序列为预测数据,基于分泌蛋白所具有的主要特征,利用SignalP v4.1、ProtCompB v9.0、TMHMM v2.0、big-PI Fungal predictor、TargetP v1.1、LipoP v1.0等在线分析程序对分泌蛋白进行预测,同时分析其氨基酸组成及分布、信号肽长度、信号肽切割位点等特征。【结果】核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白平均为74个,其氨基酸长度多集中于101～400氨基酸,所占比例为63.65%。信号肽氨基酸残基中以A最多,所占比例为22.04%; 其次是L,所占比例为19.27%。信号肽长度以19～29个氨基酸的最多,所占比例为79.62%,信号肽切割位点属于A-X-A类型。【结论】核桃细菌性黑斑病菌中分泌蛋白的有效预测,可为深入解析核桃细菌性黑斑病菌中分泌蛋白在侵染过程中所发挥的功能提供理论依据。     

中华按蚊AsAce1基因的鉴定及生物信息学分析

利用同源性搜索,在中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中鉴定出1条乙酰胆碱酯酶(Ace)家族序列,命名为AsAce1(GenBank登录号:KU900233)。该基因序列的全长为5592bp,编码区序列长度为2253bp,编码750个氨基酸。在理化性质、二级结构、三级结构、系统发生、基因结构等方面对该基因及所编码蛋白进行了预测和分析。结果表明AsAce1蛋白在按蚊中具有很高的保守性;该蛋白是亲水性蛋白,分子量、等电点分别为82.41kD,5.92,二级结构主要以不规则卷曲为主,无跨膜结构域和信号肽;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中;基因结构为两种相位(1位和2位内含子)。研究结果为AsAce1基因生物学功能的挖掘奠定了理论基础。
     

人转铁蛋白基因的克隆及序列分析

目的:克隆人转铁蛋白基因并对其编码序列进行分析.方法:以人胎肝cDNA为模板,利用PCR方法克隆人转铁蛋白基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;通过TargetP 1.1和SignalP 3.0预测信号肽;通过Clustal X(1.81)进行蛋白序列联配.结果:PCR扩增了一个长2 160 bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由698个氨基酸组成的人转铁蛋白.进一步分析发现人转铁蛋白基因有19个外显子和18个内含子,编码人转铁蛋白N端具有19个氨基酸组成的信号肽序列.人转铁蛋白与猩猩、猴子、兔子和老鼠的转铁蛋白氨基酸相似率分别为94%、91%、78%、73%.生物信息分析表明,人转铁蛋白含有高度保守的参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点,有两个序列较同源的结构域.结论:成功克隆人转铁蛋白基因,人转铁蛋白与其它物种转铁蛋白同源.     

中华按蚊AsAce1基因的鉴定及生物信息学分析

利用同源性搜索,在中华按蚊(Anopheles sinensis)基因组中鉴定出1条乙酰胆碱酯酶(Ace)家族序列,命名为AsAce1(GenBank登录号:KU900233)。该基因序列的全长为5 592bp,编码区序列长度为2 253bp,编码750个氨基酸。在理化性质、二级结构、三级结构、系统发生、基因结构等方面对该基因及所编码蛋白进行了预测和分析。结果表明AsAce1蛋白在按蚊中具有很高的保守性;该蛋白是亲水性蛋白,分子量、等电点分别为82.41kD,5.92,二级结构主要以不规则卷曲为主,无跨膜结构域和信号肽;亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中;基因结构为两种相位(1位和2位内含子)。研究结果为AsAce1基因生物学功能的挖掘奠定了理论基础。     

大鼠胰岛素增强子结合蛋白ISL1的生物信息学分析

以NCBI中收录的不同物种ISL1蛋白的相关序列信息为基础,进行生物信息学分析和功能预测。其中大鼠的ISL1基因长12307 bp,编码349个氨基酸。所编码蛋白质不含信号肽,可能是存在于内质网的亲水性蛋白。结构预测分析发现ISL1蛋白二级结构存在较多无规则卷曲和双锌指的空间结构,证实其发挥转录因子功能的结构基础。同源性比对分析显示,大鼠ISL1基因编码蛋白与人、奶牛、小鼠、金仓鼠、灰狼的ISL1蛋白高度同源,达到100%;与原鸡、斑马鱼、非洲爪蟾同源性也较高,分别达到99%、98%及97%,这说明了ISL1蛋白序列的稳定性和保守性。通过对大鼠ISL1蛋白的生物信息学分析和功能预测,为进一步探讨其分子调控机制提供重要的参考依据。     

菜豆根瘤菌CFN42全基因组非经典分泌蛋白的预测与分析

为了深入了解生物固氮的分子机理，利用SecretomeP2.0和SignalP4.1对菜豆根瘤菌CFN42全基因组进行预测，结果发现，在5963个蛋白质中，非经典分泌蛋白596个，约占总数的10%，主要涉及底物转运，毒力侵染，物质代谢等方面。在有功能描述的215个分泌蛋白中，识别了I、III、IV型分泌系统，这些蛋白质在侵染和根瘤发育方面发挥了重要作用；在381个假定蛋白中，通过结构域分析，发现了Tad、Cupin、OmPA和CsbD结构域，含有这些结构域的非经典分泌蛋白可能参与了根瘤菌的宿主专一性。在豆科植物-根瘤菌固氮体系中，非经典分泌蛋白发挥了重要作用。     

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Wzt基因参与LPS O-抗原合成和影响细菌致病性

ABC-转运系统将同质O-抗原多糖链从细胞质内膜转运到细胞周质空间合成脂多糖(LPS).通过功能互补和亚克隆序列分析在X.oryzae pv.oryzicola的基因组文库中发现了一个Wzt基因,该基因编码产物是运输O-抗原的ABC-转运系统的疏水组成部分,为ATP-结合蛋白.为区别基因来源将该基因命名为WztXooc.WztXooc编码一个35.9 ku的蛋白质.通过分析发现,WztXooc与数据库中的其他细菌包括水稻白叶枯病菌的ABC-转运系统的ATP结合蛋白质不同.在WztXooc序列中仅发现ATP-结合蛋白中4个保守基序的3个,没有发现ATP-结合位点Walker A(ATP/GTP binding sitemotif A).通过基因插入突变得到WztXooc基因突变体Mwzt.LPS分析表明:由于该基因突变使O-抗原链不能转运通过细胞质膜,不能形成完整的LPS分子,突变体菌落表面丧失了产生大量胞外多糖的能力;突变细菌不产生鞭毛,丧失了游动性和生物膜形成的能力.重要的是突变体在水稻上的繁殖能力和致病性明显下降,证明WztXooc基因与LPS合成及致病性有关.     

小鼠MT-RNR1基因的克隆及其真核转录系统的构建

采用分子克隆技术克隆小鼠MT-RNR1基因并构建真核转录系统,运用生物信息学软件预测、分析该基因的结构和生物学功能.成功克隆了MT-RNR1基因并成功构建MT-RNR1基因真核转录系统,分析其与基因库所收录基因序列的同源性为100%,该基因包含18个可能的开放阅读框架,可能编码产生13条多肽;质粒转染293T细胞24 h后显示明显的绿色荧光,说明该重组质粒在293T细胞内的转录效果较好.实验结果为后续研究MT-RNR1基因及其衍生多肽的功能提供依据,也为今后挖掘更多线粒体基因组功能做铺垫.     

卷枝毛霉苹果酸转运蛋白生物信息学分析

借助生物信息学技术预测分析卷枝毛霉苹果酸转运(malate transporter, MT)蛋白的理化特性、空间结构及功能位点,通过Protpara、PredictProtein、TMHMM Server、NetPhos等在线分析工具对MT蛋白的基本性质和结构进行分析预测。结果表明,MT蛋白疏水性强且性质稳定,属于非分泌型蛋白,由10个跨膜螺旋逆时针排列形成一个接近于椭球形的蛋白质分子三维结构;该转运蛋白有8个豆蔻酰化位点,3个ASN-糖基化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点;系统发育分析发现,卷枝毛霉MT蛋白与毛霉菌(Mucor ambiguous)的同源性最高,聚为一类,与植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的亲缘关系较远。本研究为后续探究苹果酸转运蛋白的三维结构与功能奠定了基础。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,Western Blot检测其反应原性;用重组蛋白作用于细胞,检测炎症相关细胞因子的分泌量;并对该蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PCR扩增出VceA基因,SDS-PAGE显示纯化的VceA融合蛋白大约在37 kD处,Western Blot也出现了杂交带。细胞实验表明重组蛋白刺激细胞后产生的IL-18,IL-1β,TGF-β1的含量均显著高于BSA对照组(P0.05)。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,并利用Phyre2软件成功构建了该蛋白的三维模型。结果表明,成功克隆并表达了布鲁氏菌Vce A蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,并具有致炎作用。这为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白的致病机制奠定了基础。     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.     

通过同源搜索分析线粒体蛋白转运系统的进化

基于酵母线粒体蛋白转运系统的35个亚基,作者通过同源查找的方法,在27个不同进化层次物种的蛋白组和基因组序列中搜索线粒体蛋白转运系统亚基的同源序列,利用序列之间的同源关系进而构建线粒体蛋白转运系统的进化史.结果显示,线粒体蛋白转运系统的35个亚基中有6个可以在原核物种中找到同源序列,显示了它们的原核起源;线粒体蛋白转运系统的核心亚基出现在真核生物进化早期;其他亚基在真核物种的不同进化分枝中表现出了多样性,并且可以看到一些物种特异性亚基.     

副溶血弧菌VopS效应子基因的克隆与原核表达

副溶血弧菌可通过Ⅲ型分泌系统分泌效应毒力蛋白导致真核靶细胞的细胞溶解及细胞凋亡.VopS是Ⅲ型分泌系统中的一个效应毒力因子,能通过抑制NF-κB的活性介导巨噬细胞死亡.实验将效应因子VopS的编码基因克隆到pET28a(+)载体上,成功构建了pET28a(+)-vopS重组质粒,将该质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE分析,发现在分子量约为43 kDa处有一明显蛋白表达条带.用Ni2+-NTA柱亲和层析获得纯化蛋白,浓度为175 mg/L.为进一步研究副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统致病机制提供了材料.