对虾白斑综合症病毒结构蛋白质VP24的定位研究

对虾白斑综合症病毒是一种新型的DNA病毒.VP24蛋白质是该病毒粒子的一个主要的结构蛋白质.当纯化的病毒粒子经去污剂处理后,VP24蛋白质被发现完全存在于囊膜部分,Western杂交实验也证实该结果,以上实验结果表明VP24蛋白质是病毒的一个囊膜蛋白质.利用免疫胶体金定位技术对该蛋白质的进一步研究中发现,核衣壳上未见标记的金颗粒,完整的病毒粒子上标记的金颗粒也很少,而囊膜部分破损的病毒粒子上却可观察到大量的金颗粒.我们认为VP24蛋白质是一个囊膜蛋白质,但是它的主体可能存在于病毒的囊膜和核衣壳之间.VP24蛋白质的定位研究将加速阐明病毒感染和包装的机制,并将有助于病毒的诊断和控制.     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白基因vp95表达时序分析及其抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是造成养殖对虾病害的主要病原,其300kb的双链环状DNA基因组共编码532个开放阅读框(open reading frames,ORF).蛋白VP95是WSSV的结构蛋白,在病毒囊膜蛋白和核衣壳中均有分布,由ORF wsv442编码,基因全长2 400bp.首先对基因vp95的表达时序进行分析,证明该基因属于晚期基因.为了更深入地研究该结构蛋白的功能,选择中间编码200个氨基酸的片段(1 051~1 650nt)进行克隆表达.此片段被克隆到pET-His载体上,构建好的质粒转化入表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3),经IPTG诱导后,收集细菌,超声破碎后,将含有可溶性表达重组蛋白的上清用Ni 2+-NTA agaros纯化.纯化的重组蛋白HisVP95-M200免疫小鼠,制备抗血清.为了去除血清中的杂质,用HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)亲和层析纯化柱子纯化血清中抗蛋白VP95的抗体.Western blot分析显示,未纯化的血清和纯化的抗体对病毒粒子中蛋白VP95都有很高的效价,并且具有严格的专一性.为进一步研究VP95蛋白在病毒粒子的包装中的作用,以及其在病毒的入侵过程中的功能奠定了良好的基础.     

中国对虾暴发性流行病杆状病毒的提取纯化及病原性实验

通过病毒纯化技术及电镜检测 ,发现患病的中国对虾体内有带囊膜的杆状病毒 .该病毒粒子大小为 (3 0 0～ 4 0 0 )nm× (1 60～ 1 80 )nm ,囊膜 2 0～4 0nm ,无包涵体 .人工回接实验表明 ,病虾的肝胰脏、中肠、胃、心肌组织内均分布有大量的病毒粒子 ,该病毒粒子在形态、大小、囊膜的有无及包涵体的有无等诸方面均与感染前部分纯化的病毒粒子一致 .根据柯氏法则 ,患病的中国对虾是由杆状病毒的侵袭所致 .     

对虾白斑综合征病毒非结构蛋白ICP11的研究

白斑综合征病毒(WSSV)是一种对虾养殖业中危险极大的传染性病原体,它是一种双链环状DNA杆状型病毒.ICP11是WSSV感染宿主后产生的一种高丰度表达蛋白,根据icp11基因的序列,通过PCR扩增获得了该全长基因,将其克隆在载体pET-His上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了含His标记的目的蛋白,并制备了特异性鼠抗血清.Western blot杂交实验结果显示,该蛋白不存在于纯化的病毒粒子的结构蛋白中,只存在于病毒感染的虾中肠组织的总蛋白中.这说明ICP11是WSSV的一种非结构蛋白.通过Far-western blot杂交分析,发现重组表达的ICP11会发生自身蛋白的聚合作用.凝胶过滤色谱层析法进一步证实ICP11蛋白可以聚合为二聚体.     

五种蓝舌病毒的分子系统

对蓝舌病毒(BTV)血清型2、11和13的双链RNA中L3基因的全序列进行了测定，该基因编码这种病毒的重要内壳蛋白质(VP3)，应用前人测定的血清型10和17的BTV的L3基因序列，共5种美国存在的BTV的L3基因。该病毒的每种L3基因片断都有2772个核苷酸，包含一个开放读框(ORE)。这个开放读框(ORF)编码由901个氨基酸组成的蛋白质，VP3(分子量103kD)，其等电点为6.0。用这5种蓝舌病毒血清型的核苷酸和氨基酸序列进行分子系统学分析发现，BTV-2血清型与BTV-10、11、13和17的距离较远，美国的五种血清型BTV可分为两个不同的类群。     

基于青藤碱的抗风湿性关节炎分子构建的研究进展

利用PCR技术扩增出BmDNV-1结构蛋白vp4基因,并将该基因与原核表达载体pMALc2X进行连接,转化大肠杆菌DH10B.获得重组质粒经IPTG诱导表达得到大小为96 000的融合蛋白,融合蛋白经Amylose柱纯化,使用其免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.从而为进一步研究该病毒结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。     

日本囊对虾Ran基因的克隆表达与蛋白质GTP结合活性分析

在日本囊对虾抑制性差减杂交(suppression subtractive hybrid ization,SSH)研究过程中,首次发现一段经同源比较为Ran基因的部分序列,在抗病日本囊对虾中上调表达.为了进一步探索日本囊对虾Ran基因的功能,通过RACE-PCR的方法克隆得到了日本囊对虾Ran基因全长共1 441个碱基,其中开放阅读框为645个碱基,共编码215个氨基酸,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因.还将该基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中并转化大肠杆菌BL21,37℃下诱导6 h,超声裂解表达菌株,结果表明GST-Ran融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达,蛋白大小约为50 ku,经纯化得到了纯度大于90%的GST-Ran融合蛋白.随后的GTP结合试验验证了Ran蛋白具有GTP结合活性.     

五种蓝舌病毒的分子系统

对蓝舌病毒(BTV)血清型2、11和13的双链RNA中L3基因的全序列进行了测定,该基因编码这种病毒的重要内壳蛋白质(VP3),应用前人测定的血清型10和17的BTV的L3基因序列,共5种美国存在的BTV的L3基因.该病毒的每种L3基因片断都有2772个核苷酸,包含一个开放读框(ORF).这个开放读框(ORF)编码由901个氨基酸组成的蛋白质,VP3(分子量103kD),其等电点为6.0.用这5种蓝舌病毒血清型的核苷酸和氨基酸序列进行分子系统学分析发现,BTV-2血清型与BTV-10、11、13和17的距离较远,美国的五种血清型BTV可分为两个不同的类群.     

牛轮状病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物学研究进展

轮状病毒是引起幼龄动物急性胃肠炎和腹泻的主要病因.犊牛感染轮转病毒会对集中饲养的牛群造成严重的经济损失,制约养牛产业的发展.轮状病毒的11个节段基因分别编码了6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6),其中VP4和VP7与病毒的毒力密切相关,分别决定了病毒的P型和G型.VP6是病毒的特异性抗原,也是决定轮状病毒分组的重要蛋白.通过综述VP4、VP6、VP7的分子特征及研究进展,对目前开发的疫苗产品进行了简述.     

LvCTL1与WSSV复制的相互关系研究

C型凝集素(CTL)是一类重要的先天性免疫因子,在对虾机体的免疫防御中具有重要的作用.该研究利用相对定量PCR实验检测基因表达量、绝对定量PCR实验检测病毒拷贝数、组织切片分析实验检测感染病毒细胞数.实验数据显示:WSSV感染能显著上调LvCTL1的表达;WSSV感染的LvCTL1敲降的凡纳滨对虾中,膜囊蛋白VP28表达量、病毒拷贝数和胃上皮细胞中的感染细胞数都显著高于注射dsEGFP对照组.研究结果表明:WSSV感染后,机体通过上调LvCTL1表达来抑制WSSV复制.     

对虾白斑综合症病毒P9蛋白转录水平的微阵列分析及其免疫荧光标记

从构建的对虾白斑综合症病毒cDNA文库中,我们筛选到一个拷贝数最高,编码82个氨基酸的基因(命名为p9,wsv230).该基因被克隆到pGEX-2T载体中进行GST融合蛋白的原核表达,纯化的融合蛋白GST-P9用于制备特异的多克隆抗体.利用微阵列技术和免疫荧光标记技术,对该蛋白的转录水平及其在感染细胞内的分布进行了初步研究,表明该基因为高丰度表达,推测是对虾白斑综合症病毒的一个重要基因.     

对虾白斑病毒多抗原决定簇重组蛋白的抗原性分析

为研究重组多表位蛋白制备疫苗的方法的可行性,研究通过利用目前有研究证实与对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染与致病力相关的重要决定因子囊膜蛋白VP28、VP19和被膜蛋白VP26,从这三种蛋白基因中筛选表位基因,将这些筛选到的抗原表位通过最优化的方式组合以及密码子优化,组成新的表位基因序列,命名为Y1798G,长度为509 bp。将该基因克隆到p ET-32a原核表达载体,生产抗原表位蛋白。将纯化的抗原蛋白注射到小白鼠体内,获得抗体;并通过蛋白免疫印迹(western blot)实验验证获得的抗体能否识别结合WSSV。结果表明所构建的抗原表位重组蛋白对WSSV具有特异抗原性,可见此种制备对虾白斑病毒疫苗的策略具有可行性。     

对虾白斑症病毒体内外感染的研究

WSSV可经注射、投喂或共居感染克氏螯虾和日本沼虾，病毒感染的组织匀浆物注射后发病很快，但蔗糖介质纯化的WSSV注射后发病较慢，Ficoll-400介质纯化的WSSV注射后发病时间介于前二者之间。中国对虾细胞内WSSV一般每个囊膜只含一个核衣壳，但此毒种经克氏螯虾反复增殖后，多粒包埋的病毒粒子明显增多。从病虾的每克鳃可提出约0．66mg的WSSV。含WSSV的血淋巴或组织匀浆液感染8种昆虫细胞后，传代2次仍未观察到病毒在其中复制。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)结构蛋白VP28与VP26的功能分析

对虾白斑综合症病毒(W SSV)结构蛋白功能的研究数据还不多。怎样预测并验证那些新发现的蛋白功能,为实验研究提供理论参考,是功能基因及结构蛋白的研究重点之一。利用生物信息学技术对获得的W SSV相关数据进行分析和归纳。分析数据显示结构蛋白VP28与VP26在二级结构和跨膜结构域等方面具有很高的相似度;而且,这两个蛋白与任何已知的蛋白序列没有明显的同源性,但二者的氨基酸序列彼此间具45%的相似性,提示这两个蛋白可能执行相似的生理功能。一个特别设计的细胞吸附实验用于进一步研究W SSV侵染宿主细胞的过程中VP28和VP26所扮演的角色。实验结果显示,两个蛋白均可以与对虾鳃组织来源的细胞发生特异的体外吸附,表明VP28和VP26可能参与W SSV侵染宿主细胞的初始阶段。     

猿猴空泡病毒40病毒样颗粒的制备及纯化

本研究将猿猴空泡病毒40(Simian virus 40,SV40)的主要衣壳蛋白VP1通过Bac-toBac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中大量表达,并自我装配成形态结构及免疫原性均与天然病毒粒子相同或相似的SV40病毒样颗粒(SV40virus-like particles,SV40VLPs),经表达条件优化及分子筛纯化,成功制备出高纯度的VLPs.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可见大小约为46kDa的VP1特异性条带.间接免疫荧光试验(IFA)证实VP1蛋白能够与异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体发生反应,出现明显的特异性绿色荧光,具有良好的抗原性.纯化产物在透射电镜下可见直径约45nm的病毒样颗粒,显示出成功组装了SV40VLPs,免疫印迹试验证明VLPs能够与人抗SV40阳性血清发生反应,具有良好的抗原性.     

Site-directed mutation affecting polyomavirus capsid self-assembly in vitro

Nonequivalent bonding of identical protein subunits occurs in the polyomavirus capsid were identical pentameric capsomeres occupy both hexavalent and pentavalent positions in the icosahedral surface lattice. The polyomavirus major capsid protein VP1, purified after expression of the recombinant gene in Escherichia coli, has been isolated as capsomeres that self-assemble into capsid-like structures in vitro. The ability to switch bonding specificity in different symmetry environments therefore must be intrinsic to the VP1 molecule. In vitro self-assembly provides an assay for VP1 mutations affecting capsomere and capsid formation. We report here that a directed mutation in the VP1 expression vector, leading to a protein truncated at the carboxy terminus, results in a mutant VP1 that forms capsomeres, but not capsids, in the in vitro assembly assay. The carboxy terminus of VP1 therefore appears to be involved in the specific bonding responsible for the non-equivalent association of capsomeres.     

一种云斑天牛气味结合蛋白的分离纯化

为揭示云斑天牛(Batocera lineolata Chevrolat)对气味分子的识别机制,通过荧光结合试验和葡聚糖凝胶G75(Sephadex G75)层析研究了云斑天牛对气味分子的识别情况,并对云斑天牛气味结合蛋白进行了分离纯化。结果表明,云斑天牛气味结合蛋白能与荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)产生荧光结合,云斑天牛触角部位的总蛋白提取液中存在pro. Ⅰ-Ⅻ(Protein Ⅰ-Ⅻ)12种大分子粗提蛋白,这12种大分子粗提蛋白经Sephadex G75纯化后,得到1种能与荧光探针1-NPN产生荧光结合的纯化蛋白pur-pro. I(purified protein I)。纯化蛋白pur-pro. I分子质量约为15.2 ku,对应为大分子粗提蛋白pro. Ⅻ(Protein Ⅻ)。鉴定认为,分离纯化蛋白pur-pro. I是云斑天牛的一种气味结合蛋白。