基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因.将其与大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接,构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032.经IPTG诱导后该重组菌发酵液具有交联酪蛋白的能力,表明该重组菌能够实现分泌表达.     

枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化

本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,.     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

通过改变代谢途径选育赖氨酸生产菌株

经化学诱变,通过改变谷氨酸棒杆菌B1代谢途径,筛选出以甘油、丙酮酸和高丝氨酸为碳源的营养缺陷型,该突变菌株B10的产酸率和转化率分别比出发菌株高18.097%和15.56%.     

代谢工程方法改造谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻

应用代谢工程方法对Corynebacterium glutamicum ATCC 13032生物合成乙偶姻进行了研究.在C.glutamicum ATCC 13032中导入了Bacillus subtilis 168的乙偶姻合成途径的相关基因als SD操纵子,工程菌株的乙偶姻产量为2.14,g/L.为了增加合成乙偶姻的直接前体物丙酮酸的供给,进一步敲除了丙酮酸脱氢酶复合体E1亚基的编码基因(ace E)和乳酸脱氢酶基因(ldh A),工程菌株的乙偶姻产量提高到5.09,g/L.最后,敲除了工程菌株的2,3-丁二醇脱氢酶基因(but A)以阻断副产物2,3-丁二醇的合成,在优化的溶氧条件下,菌株CGL3在基本培养基中乙偶姻产量提高到8.33,g/L,达到理论得率的51.5%.实验结果表明经过代谢工程改造的C.glutamicum ATCC 13032具有良好的乙偶姻合成能力和应用潜力.     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

利用谷氨酸棒状杆菌高效表达枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺

谷氨酰胺合成酶(GS)是用于合成L-谷氨酰胺(L-Gln)过程中的关键酶,然而GS的酶活受到多种因素的影响,导致其酶活不强,产物L-Gln偏低.本研究以GS的基因为研究对象,构建谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的高效表达系统.利用C.glutamicum中的两种强启动子:tac启动子(Ptac)和麦芽糖启动子(Pmal),比较不同启动子的作用下GS的酶活力;其次,为了避免腺苷酰化对C.glutamicum的GS的抑制作用,将GS的腺苷酰化位点突变成苯丙氨酸(Tyr405Phe);同时由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的GS不受腺苷酰化作用的影响,故将Bacillus subtilis的GS基因导入到C.glutamicum的表达系统中,比较两种基因来源不同GS的酶活高低,以期达到高产L-Gln的目的.本研究第一次应用Bacillus subtilis来源的GS在C.glutamicum的系统中表达.最终的结果表明,在C.glutamicum的表达系统中,Ptac比Pmal的效果更好,来自Bacillus subtilis的GS比来自C.glutamicum的GS酶活力更高.重组菌BJ2有最高的酶活力和产量,L-Gln的最终产量达到32.5 g/L.     

钝齿棒杆菌B-9有关谷氨酸合成途径的研究

实验测定了B-9菌二级种子和三个发酵时期的无细胞制剂的若干种酶的活性。NADPH联系的谷氨酸脱氢酶、谷丙和谷草转氨酶均有显著活性,种子缺天冬氨酸酶活性。NADPH联系的谷氨酸合成酶活性接近于谷氨酸脱氢酶活性的1/10。谷氨酸合成途径,应以谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸氨化作用为主;但谷氨酸合成酶和天冬酶酸酶也可能参予作用。葡萄糖降解类似于其它生产菌株,通过EMP途径和HMP歧路。存在乙醛酸旁路,α-酮戊二酸氧化活力弱。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和依赖于NADP的苹果酸酶活性均低。     

棒状杆菌表达载体pJL23的构建

质粒ｐＧＡ４６－４带有从谷氨酸棒杆菌染色体上分离到的有启动功能的片段,用ＰＣＲ技术从ｐＧＡ４６－４中扩增了该片段的关键区域;启动子ＰＧＬ,将该启动子经ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后,与大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１的ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨⅠ大片段连接,再接入Ｘｙｌ Ｅ ｇｅｎｅ和棒状杆菌质粒ｐＸＺ１０１４２,构建成棒状杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＪＬ２３。用邻苯二酚双加氧酶基因检测表明,该表达载体可在棒状     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

谷氨酸棒杆菌发酵生产1,5–戊二胺的代谢流分析

为了提高糖类的利用效率,加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动,提高尸胺产量,对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析,找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点,并通过改变溶氧及添加辅酶NADPH对关键节点进行验证.结果表明:6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点,增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸,促进碳源向合成尸胺的方向流动,从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%).该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础.     

地衣芽胞杆菌中过表达丙酮酸羧化酶提高杆菌肽产量

拟通过过表达丙酮酸羧化酶基因pyc A,获得杆菌肽高产菌株,提高杆菌肽产量.构建pyc A基因过表达工程菌株DW2/p HY-pyc A,以p HY300plk转化菌株DW2/300为对照.经过发酵研究验证,DW2/p HY-pyc A杆菌肽效价为767. 7U/m L,比DW2/300效价提高了14. 5%,另外在发酵过程中DW2/p HY-pyc A的生物量有所提高,且胞内草酰乙酸的含量提高了18. 6%.经过对DW2/p HY-pyc A的基因相对转录水平分析后发现,DW2/p HY-pyc A中TCA循环合成酶基因的转录水平均有所增加,该结果表明在pyc A基因过表达菌株中,TCA循环的代谢较对照菌株有所提高.因此,通过过表达pyc A,可以增强TCA回补反应,进而提高草酰乙酸的含量和强化TCA循环,最终提高了杆菌肽组成氨基酸的供给,可以实现杆菌肽的高产.     

谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究

以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.     

透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.     

三种不同磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

应用PCR技术分别克隆了集胞藻6803、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因,构建重组大肠杆菌。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,来自集胞藻6803和大肠杆菌的PEPC实现了高效表达,而来自鲍曼不动杆菌的PEPC表达较弱,提示密码子偏好性的影响。前两菌提前进入对数生长期,来自鲍曼不动杆菌PEPC工程菌却延迟生长,但这3种重组菌发酵24h后的生物量与对照菌几乎相同。如果排除质粒复制造成的代谢负荷,过表达PEPC促进了宿主菌的生长,推测是因为重排了代谢流量。     

氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响

研究了腺苷合成途径中不同前体氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响。其中谷氨酸对腺苷合成的促进作用最大,能提高产苷30%以上。谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸也能促进腺苷合成,分别提高16%,14%,10%和6%。进一步研究添加谷氨酸后发酵液中NH4 浓度、有机酸浓度和胞内NAD 浓度的变化,发现添加谷氨酸能提供稳定的NH4 供应,并提供重要的代谢中间物α-酮戊二酸。同时,发酵液中乙酸和丙酮酸的浓度比对照低,胞内NAD 浓度较高,糖酵解生成的丙酮酸能顺利地进入TCA循环,从而能为菌体和腺苷合成提供充足的能量和前体,促进腺苷的合成。     

基于cdd基因敲除和嘧啶操纵子转移的胞苷产生菌的研究

以大肠杆菌作为出发菌株,通过基因工程手段对其进行改造,旨在提高胞苷产量.首先,通过Red重组系统敲除了大肠杆菌MG3028基因组上的胞苷脱氨酶基因(cdd),阻断了胞苷的分解代谢.然后,构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021,并将其转入E.coli MG3028(△cdd).与出发菌株E.coli MG3028相比,E.coli MG3028(△cdd)的胞苷产量提高了近2倍,而尿苷产量降低了近75%,携带重组质粒pPYR3021的菌株胞苷产量较出发菌株提高了近6倍.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.