使用微波诱变选育产物耐受型地衣芽胞杆菌以提高杆菌肽发酵水平

【目的】杆菌肽是一种重要的饲料添加剂,其发酵生产过程中存在产物反馈抑制现象,选育产物耐受型生产菌对于提高发酵水平必要。【方法】以Bacillus licheniformisY822为出发菌株,使用微波诱变技术选育产物耐受型菌株,进一步以敏感指示菌复筛,筛选杆菌肽高产菌株。【结果】选育得到产物耐受型生产菌Bacillus licheniformis Y8228X,杆菌肽产量和产率分别达到847.28 U/mL和16.74 U/mL/h,与出发菌株相比发酵水平显著提高。【结论】微波诱变结合产物耐受型菌株筛选是一种选育杆菌肽高产菌株的快速、有效方法。     

高产杆菌肽菌株的筛选及培养条件研究

采用细胞融合技术得到的菌株与不同来源地衣芽孢杆菌菌株,进行深层液体发酵生产杆菌肽,研究了不同菌株,不同碳源,不同量锌和磷量诸因素对杆菌肽高产的影响.结果表明,1号菌比B-1号、B-2号、3号、4号株菌的效价高,为5.80×102Iu.mL-1.以柠檬酸为碳源时,磷的用量为0.10~0.20 mmol.L-1的最佳培养基中培养时,最有利于杆菌肽的合成,锌的用量10%,其发酵液中杆菌肽效价最高,可达8.86×102~9.85×102Iu.mL-1.     

短小芽孢杆菌sRNA Bpsr112的鉴定及功能研究

为了给短小芽孢杆菌的改造提供新思路,提高碱性蛋白酶产量,实验室前期对短小芽孢杆菌进行了转录组测序,预测了短小芽孢杆菌的sRNA.本研究通过生物信息学方法和Northern杂交鉴定了一个新的sRNA Bpsr112.然后构建了Bpsr112的敲除型菌株和过表达菌株,利用相关菌株进行了生长曲线、盐胁迫和蛋白酶活等实验,再利用SDS-PAGE检测胞外蛋白酶AprE的表达水平.结果表明,在发酵至60 h和72 h时,与对照菌株相比,敲除型菌株酶活显著降低（P<0.01）,过表达菌株酶活显著提高（P<0.01）;同时SDS-PAGE结果表明,AprE蛋白含量在敲除菌株中降低,在过表达菌株中提高,说明sRNA Bpsr112对短小芽孢杆菌蛋白酶活具有正调控.本研究鉴定了短小芽孢杆菌中的sRNA,并发现Bpsr112对蛋白酶活具有促进作用.     

提高多粘杆菌产硫酸粘杆菌素生物效价的研究

通过紫外诱变和优化培养基来提高发酵产品硫酸粘杆菌素的生物效价.结果表明,培养基进行优化后,硫酸粘杆菌素发酵液的生物效价可达6.03×104U/mL,较未优化的2.49×104U/mL提高1.42倍;将诱变后获得的斜面突变菌株在已优化的发酵培养基上培养后,硫酸粘杆菌素发酵液的生物效价提高至8.10×104U/mL,分别是诱变前未优化与优化的3.25倍与1.34倍,提高率分别为225%和34%.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

杆菌肽生产菌种选育及发酵新工艺研究

杆菌肽是一种重要的饲料添加剂,开展菌种选育和发酵工艺研究提高杆菌肽产量十分必要。使用紫外线诱变技术选育淀粉酶分泌能力增强菌种,以加快杆菌肽积累速率。通过静态吸附和解吸实验筛选吸附杆菌肽的树脂。借助发酵吸附分离耦合试验以解除产物反馈抑制,并考察树脂加入时间对杆菌肽产量的影响。选育得到的菌株Bacillus licheniformis Y8226A发酵周期明显缩短。借助发酵吸附分离耦合策略,发酵开始30 h后在50 m L发酵液加入D152树脂1.0 g,最终杆菌肽产量与对照组相比提高了27.40%。通过紫外线诱变选育得到杆菌肽高效生产菌种,使用D152树脂开展发酵吸附分离耦合试验可显著提高杆菌肽产量。     

微波诱变选育产物耐受型地衣芽胞杆菌以提高杆菌肽发酵水平

杆菌肽是一种重要的饲料添加剂,其发酵生产过程中存在产物反馈抑制现象,选育产物耐受型生产菌可提高发酵水平。以Bacillus licheniformis Y822为出发菌株,使用微波诱变技术选育产物耐受型菌株,进一步以敏感指示菌复筛,筛选杆菌肽高产菌株。选育得到产物耐受型生产菌Bacillus licheniformis Y8228X,杆菌肽产量和产率分别达到847.28 U/m L和16.74 U/(m L·h),与出发菌株相比发酵水平显著提高。微波诱变结合产物耐受型菌株筛选是一种选育杆菌肽高产菌株的快速、有效方法。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌中的组成型表达

枯草芽胞杆菌ribR基因编码单功能黄素激酶,催化核黄素转化为FMN.ribR基因作为ytmI-ytnM操纵子的一部分,其表达调控机制尚不清楚.用PCR方法扩增了枯草芽胞杆菌veg基因的启动子vegP,连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pHP13上,构建了表达型重组质粒pHP13-V.用PCR方法扩增了ribR基因,连接到pHP13-V上,构建了重组质粒pHP13-VR.将pHP13-VR转化产核黄素的枯草芽胞杆菌24A1,使ribR基因在24A1中组成型表达,得到菌株24A1/pHP13-VR.与24A1相比,24A1/pHP13-VR菌落由亮黄色变为微黄色,核黄素产量下降为1.26 mg/mL,下降了45%.结果说明,在ribC基因突变背景的过量合成核黄素枯草芽胞杆菌中,ribR基因的存在对菌株的核黄素发酵有一定的抑制作用.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.     

氧化葡萄糖酸杆菌的选育及其发酵条件优化

目的 提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量.方法 采用紫外诱变育种、梯度平板半理性设计筛选、单因素实验进行培养条件优化、2 L发酵罐内进行补料培养.结果 筛选到了一株生物量高产菌株,命名为Gouv2007,其生物量比原始菌株提高了11.2%,脱氢酶比酶活与原始菌株持平,培养时间缩短了6 h.该菌生长的最佳碳源为山梨醇,氮源为酵母粉,无机离子为硫酸镬和磷酸氢二钾;最佳培养条件为:培养温度28℃,500 mL烧瓶装液量100 mL、摇床转速200 r/min、培养基的初始pH自然.在最佳条件下培养,其生物量为1.34 g/L,比原始菌株提高了50.6%,脱氢酶比酶活有所提高.在2 L发酵罐内补料培养,其生物量达到了5.58 g/L.结论 通过紫外诱变育种和条件优化提高了该菌的生物量,并在发酵罐内进行了小试.     

巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA对大肠杆菌耐受性的影响

巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)具有较高的醋酸耐受性,常用于醋酸的发酵生产.微生物中核酸修复酶Uvr A与菌体对酸、热等不良环境的耐受性相关,本论文克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvr A,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达,研究其对大肠杆菌醋酸、低p H、热和过氧化胁迫条件耐受性的影响.结果表明,分别在0.5%,醋酸、p H 3、53,℃、0.15%,H2O2这4种胁迫条件下处理40,min后,重组菌E.,coli JM109/p MV24-uvr A的存活率分别是对照菌E.,coli JM109/p MV24的11.2、4.7、19.2和7.5倍,说明来源于巴氏醋杆菌的核酸修复酶Uvr A能够提高大肠杆菌对醋酸、低p H、热与过氧化的耐受性,其原因可能是由于重组表达Uvr A提高了菌体在不同胁迫条件下对DNA的保护或修复能力.     

苏云金杆菌固体发酵工艺研究

苏云金杆菌(Bacillus Thuringiensis简称B.t)是农业生产中最广泛应用的微生物杀虫农药.为了在降低生产成本、减少废水排放的同时,提高生产菌发酵水平和毒力效价,对本实验室选育的菌株B.t NH-1的固体发酵工艺条件的优化进行了进一步研究,确定了适合于B.tNH-1生长、产生芽孢的最佳条件.研究结果固体发酵水平基本稳定在2.37×1010个/g,粉剂烘干后,测其毒力效价,可以稳定在17000 IU/mg以上,,超过国内文献报道固体发酵的最高水平.     

一株高产乳酸鼠李糖乳杆菌的选育

采用紫外线和Co60照射联合诱变鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)JCM1553菌株,选育得到1株L-乳酸高产突变株SCT-10-10-60.经77代传代培养证实该菌株L-乳酸发酵遗传稳定.在37℃,200rpm下,该菌株摇瓶发酵葡萄糖60h的发酵液乳酸浓度达到最大,为195.67g/L,发酵糖酸转化率达到95.33％,比出发菌株最大乳酸产量、发酵速率和糖酸转化率分别提高了16.24％、50.13％和17.81％.相同条件下该菌株发酵木薯淀粉84h的乳酸浓度达到最大值,为203.33g/L,糖酸转化率达到78.85％,比出发菌株最大乳酸产量和发酵速率均提高了29.49％,糖酸转化率则提高24.53％.该菌株发酵产物的L-乳酸含量高达96.75％,与出发菌株(96.97％)无统计学显著差异(P＞0.05).该高产菌株乳酸发酵性能提高的主要原因是菌体增长速率加快.其L-乳酸发酵性能显著优于现有的生产菌株,具有较高的潜在工业价值.     

整肠生菌发酵中杆菌肽高产的代谢调控

从目前厂家利用整肠生菌发酵生产杆菌肽效价低的实际情况出发,为了提高产量和质量,从杆菌肽代谢途径--次级代谢和初级代谢关系、碳代谢和磷代谢调节几个方面对杆菌肽合成的影响,论述了在发酵生产过程中,如何进行控制碳源的种类和数量以及磷的用量问题,碳源以3%的柠檬酸为好,磷的用量以0.1～1.0 mmol/L为宜,以便更有利于杆菌肽形成,从而达到高产的目的.同时为这种新型抗生素,即杆菌肽高产提供了必要的理论根据.     

枯草芽孢杆菌KJ发酵豆粕制备新型蛋白肽饲料的研究

以脱脂豆粕粉为原料,具有分泌丰富酶系能力的菌株枯草芽孢杆菌KJ为发酵菌株,通过单因素试验,确定最优发酵降解条件.得出最佳发酵工艺:豆粕粉6％,葡萄糖2％,接种量9％,菌龄12 h,经发酵48 h后,豆粕粉蛋白中小分子肽含量达58.86％,比发酵前提高了37.99％.     

液体发酵饲料植物乳杆菌诱变育种的研究

通过紫外线诱变植物乳杆菌选育具有良好发酵性能的液体发酵饲料专用乳酸菌.试验中采用紫外线的最佳诱变时间为120s,并用溶钙圈法对诱变后的菌株进行初步筛选,在MRS-CaCO_3培养基上得到溶钙圈直径较大的菌株79株.通过对这79株菌株的液体发酵饲料进行乳酸含量的测定,最终得到一株乳酸高产菌株UR-3,显著提高了产乳酸量(p0.05),在液体发酵饲料中,该菌株产乳酸能力较出发菌株提高了44.53%.