枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因.将其与大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接,构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032.经IPTG诱导后该重组菌发酵液具有交联酪蛋白的能力,表明该重组菌能够实现分泌表达.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.     

枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化

本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,.     

利用Bacillus licheniformis NK-03合成聚谷氨酸及其合成酶基因pgsBCA的克隆

分离到一株能合成γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的细菌,通过16S rRNA序列同源性分析、计算机微生物分类鉴定系统BIOLOG-System 4.20等方法,确立该菌株为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus licheniformis NK-03.该菌合成的γ-PGA所含的L-谷氨酸单体可高达98%,且重均分子量(Mw)为1360000.另外,利用pXMJ19质粒将B.licheniformis NK-03的γ-PGA合成酶基因pgsBCA克隆到了Escherichia coli JM109中,使其成功表达合成了重均分子量为42 433的γ-PGA.同时,通过比较B.licheniformis NK-03与已报道菌株pgsBCA基因编码氨基酸序列的同源性,发现基因簇中pgsC基因编码的氨基酸序列最为保守.     

功能模块的集成与测试研究

谷氨酸棒杆菌作为棒杆菌中的模式生物,拥有多条完整的芳香化合物代谢途径,全基因组测序的完成为在谷氨酸棒杆菌中进行代谢调控研究提供了良好的生物信息学平台;该菌包括基因敲除及互补在内的遗传操作系统非常成熟,是研究芳香化合物代谢调控机制的良好模型。该研究旨在利用棒杆菌等模式生物中的莽草酸合成及芳香化合物代谢相关元件进行元件适配性研究,同时结合生物信息学、分子生物学及生物化学方法发掘其他微生物中这两类元件,并对元件进行表征、改造及标准化并建立元件库;选取高效能的功能元件拼接组装为功能模块,并在棒杆菌等底盘细胞中进行检测适配性,从而构建出高效合成以莽草酸为代表性芳香化合物的人工细胞。到目前为止,研究工作完成了谷氨酸棒杆菌莽草酸合成途径酶元件的鉴定,重点完成了谷棒DAHP合酶和分支酸异构酶功能表征及元件间适配性关系,获得大量潜在的莽草酸合成相关代谢元件;并对部分代谢元件进行功能验证和表征;同时建立高效蛋白表达及酶活测定体系。鉴定了谷棒莽草酸途径的7个酶以及分支酸异构酶,完成了谷棒DAHP合酶、分支酸异构酶、脱氢奎尼酸脱水酶以及莽草酸激酶功能表征,揭示了DAHP合酶和分支酸异构酶相互作用机理和调控关系。获得了3 549个莽草酸途径相关基因序列,确定了516个合成目标基因,完成了这些基因密码子优化和基因序列重新设计,选取了37个脱氢奎尼酸脱水酶基因人工合成,构建标准元件库,并表征了它们的酶促动力学参数。构建并验证了快速高通量的筛选—优化—合成—表征莽草酸途径元件库的Pipeline。另外在调控元件库构建方面,构建了包括RBS、Promoter、Terminator以及Insulator等4类共226个元件的调控元件库,为莽草酸通路模块的优化和精细调控的奠定了基础。模块的组装和优化方面,构建了基于Ribo J Insulator的基因表达定量调控模型,合成了莽草酸本地途径酶元件和调控元件元件进行模块组装,并在底盘细胞谷氨酸棒杆菌中实现了表达,对最优配比进行了初步筛选,将莽草酸产量提高了7倍。     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L–异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA(F383V)连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L–异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L–异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L–蛋氨酸、L–赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L–苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用westernblot方法鉴定LTB表达情况.Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别.表明LTB蛋白在重组干酪孔杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础.     

柱前衍生化HPLC法测定发酵液中L-瓜氨酸和L-鸟氨酸含量

建立一种应用异硫氰酸苯酯将L-瓜氨酸和L-鸟氨酸柱前衍生后进行定量分析的高效液相色谱法.实验结果表明,瓜氨酸在0.2～2.0 mg/mL范围内线性回归显著(R2=0.999 8),平均回收率99.87%;鸟氨酸在0.2～2.0 mg/mL范围内线性回归显著(R2=0.999 7),平均回收率100.92%.应用该方法对发酵液中L-瓜氨酸和L-鸟氨酸含量进行测定取得了满意的结果,能有效指导谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸的发酵生产.     

表达异源木糖异构酶对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响

微生物细胞木糖代谢对生物质水解液全利用和促进特定重要化学品的合成具有重要意义.谷氨酸棒杆菌为重要的氨基酸工业生产菌株,由于缺乏木糖异构酶编码基因而不能代谢木糖.本研究通过质粒过表达不同来源的木糖异构酶基因xyl A,实现了菌株对木糖的利用,其中大肠杆菌木糖异构酶效果最好.由于木糖异构酶的活性是制约菌株代谢木糖的瓶颈因素,因此对启动子的SD序列进行了替换以促进翻译效率,使菌株在木糖培养基中生长的A600值达到出发菌的2.7倍.通过基因组整合3个拷贝的优化后xyl A表达模块,实现了无质粒的木糖代谢工程菌株的构建,为后续谷氨酸棒杆菌利用木糖生产高附加值化学品的代谢工程研究奠定基础.     

谷氨酸棒杆菌串联生产氨基酸和有机酸的发酵工艺

为进一步提高谷氨酸棒杆菌在工业生产中的利用效率,根据其好氧环境下可发酵生产氨基酸,厌氧条件下可积累有机酸的特性,建立了好氧、厌氧两阶段生产氨基酸及有机酸的串联发酵工艺。研究表明:在好氧条件下谷氨酸棒杆菌以80 g/L葡萄糖为碳源生产L-鸟氨酸15 g/L,糖酸转化率为18.75%;好氧发酵结束后收集菌体转入厌氧发酵工艺,以40 g/L葡萄糖为碳源,发酵液中积累乳酸19.58 g/L、乙酸1.34 g/L、丁二酸18.37 g/L,综合糖酸转化率达到98.88%。整个串联发酵工艺的实现,有效地利用了生物质资源、降低了生产能耗、减小了环境污染,有助于提高整体的经济效益,同时也为后续利用代谢工程进一步改造谷氨酸棒杆菌,并将其应用于更广泛的氨基酸、有机酸联合生产奠定了基础。     

HIV-1C亚型DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的研究

 构建含中国流行株HIV-1 C亚型核心蛋白gag基因的重组质粒pVAX-gag,并在体外进行了表达与鉴定.同时构建了含此gag基因的原核表达质粒pGEX-gag,表达纯化并鉴定重组蛋白Gag.以质粒pVAX-gag免疫Balb/C小鼠后,用ELISpot和流式细胞仪检测其细胞免疫反应.再以纯化后的重组蛋白Gag作为包被抗原,用ELISA检测其体液免疫反应.结果显示重组质粒pVAX-gag免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,且免疫剂量和免疫效果存在一定的正相关性.重组原核表达质粒pGEX-gag的表达产物能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应,可用于抗HIV抗体检测.     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用

以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建

胰岛素样生长因子结合蛋白7（简称IGFBP7）广泛存在于多种正常的组织中，但在相应的肿瘤细胞中的含量极微。试验表明，它在肿瘤发生的不同阶段抑制其生长。采用RT－PCR和Nest-PCR方法，从正常的小鼠脾脏中扩增得到IGFBP7 cDNA片段，测序正确后，克隆于融合表达载体pRSETC中构建原核表达重组体。