酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-(-)-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-(-)-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km(NADH)=99.2μmol/L和Km(苯乙酮酸)=263.3μmol/L.     

酿酒酵母不对称合成(R)-(-)-扁桃酸甲酯

采用本实验室筛选到的酿酒酵母LH1催化苯甲酰甲酸甲酯不对称合成(R)-(-)-扁桃酸甲酯.在单相体系中考察了初始底物浓度、细胞浓度、pH、温度、辅助底物、葡萄糖浓度和反应时间等因素对产物得率和对映体选择性的影响,获得了较佳的还原条件.当细胞浓度75 g(干细胞)/L,葡萄糖浓度30 g/L,底物浓度100 mmol/L,pH 8.0,温度30℃,反应时间30 h时,产物扁桃酸甲酯的得率达94.3%,(R)-(-)-扁桃酸甲酯的对映体过量值(ee)达95.0%.在苯甲酰甲酸甲酯的转化反应中,酿酒酵母LH1菌株表现出非常好的对映体选择性,且ee值受环境因素的影响非常小.     

微生物转化苯乙酮酸合成R-(-)- 扁桃酸

考察了酵母菌株FD11b不对称还原苯乙酮酸生产R-(-)-扁桃酸的重复使用性能.菌株FD11b在持续6批次(14 d)的还原反应中,一直保持着较高的催化还原活性,且目标产物R-(-)-扁桃酸的对映体过量值(e.e.值)均高于96.5%.在30 L发酵罐上进行Fed-Batch放大试验,当菌体浓度(细胞干重,以下同)为12.5 g/L,底物苯乙酮酸浓度控制在20~30 mmol/L时,还原反应49 h,产物浓度可达125 mmol/L,产物得率为96.1%,e.e.值为98.5%.     

反相离子对色谱法测定手性生物转化中扁桃酸与苯乙酮酸

建立一种同时测定生物不对称转化发酵液中扁桃酸及苯乙酮酸含量的反相离子对高效液相色谱方法.色谱柱为HypersilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-25mmol·L-1磷酸二氢钾缓冲液(内含6mmol·L-1四丁基溴化铵,NaOH调pH至7.0)(体积分数15∶85),流速为1.0mL·min-1,检测波长220nm,柱温为室温.扁桃酸与苯乙酮酸在0.5～20mmol·L-1内,其浓度与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.9994,0.9997).二者的加样回收率均为96.5%～100.6%.当信噪比(S/N)为3时,二者的最低检测浓度分别为2.4和8μmol·L-1.该方法简便、准确、灵敏度高,可用于手性生物转化中扁桃酸与苯乙酮酸的定量分析.     

反相高效液相色谱法检测手性药物前体扁桃酸

采用反相高效液相色谱法分离测定手性药物前体扁桃酸及其底物苯乙酮酸.反相色谱柱为VarianC18柱,以甲醇-磷酸盐缓冲液(体积分数=1∶9)作为流动相,流速为1.0mL·min-1,检测波长为297nm,柱温25℃.该法测定的灵敏度高,可用于发酵液中苯乙酮酸和扁桃酸的定量测定.扁桃酸及苯乙酮酸浓度在5～20mmol·L-1范围内呈现良好的浓度-峰面积线性关系.     

固定化细胞海藻酸钙凝胶内的扩散特性

采用浸入法,测定葡萄糖、苯乙酮酸和扁桃酸等3种物质在固定化酵母细胞海藻酸钙凝胶内的有效扩散系数.实验结果表明,相同条件下,葡萄糖的有效扩散系数De随着海藻酸钠浓度的提高而下降,优化的海藻酸钠质量分数为0.02.葡萄糖的有效扩散系数大于扁桃酸和苯乙酮酸.初始包埋量为54.4 g.L-1的固定化酵母细胞经增殖8 h后,扁桃酸在胶珠内的有效扩散系数为0.36×10-4cm2.min-1,明显小于未增殖或未包埋细胞.     

产木聚糖酶海洋微生物的筛选与诱变育种

以自制木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从多个海洋来源样品中一共筛到60株有透明圈且形态各异的菌株,摇瓶发酵结果显示,38株具有产木聚糖酶能力,其中B659菌株产酶能力最高,酶活力为525.3 U·m L-1.结合B659菌株的形态特征和16S r DNA序列分析鉴定该菌株属于Bacillus属.对B659菌株进行紫外诱变,筛选得到酶活提高13.9%且稳定遗传的突变菌株G3-17;对G3-17菌株进一步进行微波诱变得到酶活较G3-17菌株高出11.6%且稳定遗传的突变菌株W1-40.对B659菌株和W1-40突变菌株进行发酵试验,72 h时W1-40菌株的酶活力达到645.2 U·m L-1,比B659菌株(517.9 U·m L-1)提高24.6%.     

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生菌诱变效应的研究

利用低能(30keV)氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658,研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应.结果表明,BF7658菌株存活率曲线是典型的"马鞍型"剂量-效应曲线,在"马鞍型"区域对应注入剂量50×1014～100×1014 ions/cm2下具有较高的突变率.通过诱变筛选到一株最适作用pH为5.0,较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株,编号TUST743.该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343U/mL.该酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活为61%和38%,说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性.经连续传代实验,表明该菌株遗传性质稳定.     

产脂肪酶菌株Acinetobacter calcoaceticus UN9的诱变选育

本实验菌株醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)M1-7的最佳紫外诱变时间为60,s.利用紫外诱变后涂布到添加不同脂肪酶底物和分解产物的分离培养基,筛选出具有抗性的正突变株.其中柠檬酸钠抗性突变菌株UN9最高酶活力达15.960,U/mL,比出发菌株提高了130.97%,远远高于琥珀酸钠、正丁酸、正己酸、三丁酸甘油酯等抗性突变菌株.经5次传代后,菌株UN9遗传性能稳定,平均酶活力为15.866,U/mL.     

DS 9701菌株的紫外诱变及PHB解聚酶高产菌株的筛选

以青霉(Penicillium.sp)DS 9701为出发菌株,通过紫外线诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法,获得一突变株,编号DS 9701-M 09.该突变株的PHB解聚酶活力是原始菌株的2.3倍,经传代培养,该菌株的PHB解聚酶高产特性稳定遗传.     

乙酰氨基己酸锌的急性毒性试验和Ames实验

目的与方法:本文研究乙酰氨基己酸锌对小鼠的急性毒性作用以及用鼠伤寒沙门氏菌突变株的回复突变性检测乙酰氨基己酸锌是否具有致突变性.结果与讨论:结果表明,乙酰氨基己酸锌的小鼠腹腔注射的半数致死量LD50=364.69mg/kg;在加与不加S9的条件下,对TA97,TA98,TA100和TA102的致突变作用为阴性.     

定点突变技术在转氨酶改造中的应用

对定点突变技术进行简要介绍，并对此技术在改造转氨酶的活性、稳定性及底物特异性等方面的最新进展进行了综述。同时，也对定点突变技术的发展趋势进行了展望。以期能为该领域的研究人员提供有价值的参考。     

用细小病毒H-1探测人细胞中的直接诱变与间接诱变途径

用细小病毒H-1为探针,可在人细胞中检测由紫外线照射诱导的三种不同致突变途径.直接突变产生于细胞的结构性复制(或修复)功能对受损DNA模板的复制;间接无靶突变和间接有靶突变分别产生于紫外线诱导的易错修复功能对完整模板和模板上的靶损伤的作用.在低剂量范围内,间接无靶突变在某些DNA毒剂诱导的细胞突变中起主要作用.某些DNA损伤,如烷化剂诱导的次级损伤(无碱基位损伤)可作为诱导性易错修复功能的靶损伤.     

T-DNA transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transformation method was applied to transform Nodulisporium sylviforme fusant HDF-68, a taxol-producing fungus. We constructed a binary vector pBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of T-DNA. Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.tumefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hygromycin-resistant transformants per million conidia. Putative transformants were found to be mitotically stable. The molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of the T-DNA into the host genome. This transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesis in N.sylviforme fusant HDF-68, and the development of such system lays a solid foundation for constructing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.     

法夫酵母人工诱变及突变株筛选的研究

用硫酸二乙酯对法夫酵母进行了诱变，并用薄层色谱法及高效液相色谱法对突变株进行了筛选鉴定,当诱变剂浓度为1％、诱变温度为20℃时，法夫酵母诱变处理的最适时间约为5min．根据视觉差异分离二苯胺平板上长出的法夫酵母菌落，用薄层色谱法初筛，并用液相色谱法鉴定出了虾青素高产菌株、虾青索低产菌株、类胡萝卜素组成缺陷菌株．     

混合菌群诱变及诱变菌群对闪锌矿浸出的影响

将采自不同地区的混合菌分别培养于以黄铜矿和黄铁矿为能源的9 K培养基中,并以该培养物作为出发菌群,用亚硝酸钠(NaNO2)、硫酸二乙酯(DES)、紫外线(UV)及其组合为诱变剂,对混合菌群进行诱变。诱变后,经过连续浸矿筛选,得到对闪锌矿浸矿效果最好的诱变菌群E。浸矿试验结果表明:在9 K和Leathen培养基中,用诱变菌群E浸出闪锌矿40 d后,Zn2 的浸出率分别比对照组提高68%和84%;离心收集Leathen培养基中的菌体和矿样浸渣,弃除液体,加入新的Leathen培养基,在30℃和200 r/min条件下,恒温摇床培养20 d后,诱变菌群E对闪锌矿中Zn2 的二次浸出率比对照组高92%。     

抗冻蛋白基因定向突变及其抗冻关系的研究

为探讨抗冻蛋白的抗冻机制,根据抗冻活力较高的肝型抗冻蛋白的氨基酸组成,改造皮肤型抗冻蛋白基因,使皮肤型抗冻蛋白基因的10位氨基酸－丙氨酸（A）改造成天冬氨酸（D）,方法：合成一段含有突变位点的DNA片段,用其取代野生型DNA上相对应的片段,DNA测序法筛选阳性克隆并表达该蛋白,Western-blot法、氨基酸组成分析法、及质谱法鉴定表达蛋白,测定突变后抗冻蛋白的的活力并与野生型比较,以期揭示抗冻蛋白的抗冻机制。     

溶源性乳酸菌紫外诱变前后生长特性的初步研究

以OD值及CFU,pH三个指标对嗜热链球菌的生长动力学性质进行了初步的研究,分析了紫外诱变后嗜热链球菌生长动力学性质的变化及原因。实验结果表明,嗜热链球菌的生长特性符合典型的一步生长曲线规律。在整个培养期内,pH随培养时间的延长而降低。温和噬菌体经过一定条件的紫外诱变后转变为烈性噬菌体,导致细菌生长缓慢。