HDAC1、8在肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化中的表达及意义

目的:观察TGF-β1作用下,肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN在EMT过程中HDAC1、8的表达情况及TSA对TGF-β1诱导细胞EMT的影响。方法:将TGF-β1加入到体外培养的细胞中,于不同时间收取细胞,采用WB及Real-time RT-PCR检测HDAC1、8及E-cad、α-SMA的表达情况。然后将TGF-β1加入经过TSA预处理的细胞中,于不同时间收取细胞,重新检测上述基因。结果:加入TGF-β1后,E-cad蛋白表达下调;α-SMA蛋白表达上调;HDAC1蛋白表达上调;HDAC8蛋白表达下调。E-cad mRNA表达下调;α-SMA及HDAC8的mRNA均于12 h表达上调,6 h、24 h表达下调;HDAC1 mRNA表达于6 h下调,24 h上调。加入TSA后,E-cad蛋白表达上调;α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表达均下调。E-cad mRNA表达上调;α-SMA mRNA表达于6 h、12 h上调,24 h下调;HDAC1 mRNA表达下调;HDAC8 mRNA表达上调。结论:TGF-β1体外诱导的RLE-6TN细胞EMT,可以通过应用TSA抑制其获得α-SMA表型、失去E-cad表型,从而部分逆转TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮EMT。     

TGF-β1与EGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞表型及功能的影响

目的:探讨TGF-β1与EGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)的影响。方法:将细胞分成对照(C)、TGF-β1(T)、EGF(E)及TGF-β1+EGF(TE)组。采用相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光检测α-SMA表达,W.B检测上皮、间质细胞标记物、MMPs及信号蛋白的表达;流式细胞术检测凋亡情况。结果:T及TE组RLE-6TN发生EMT转变并见间质标记物及MT1-MMP、MMP2表达上调,E组Vimentin、MT1-MMP、MMP2及CD147表达上调;T与E组p-ERK、p-38MAPK及p-Akt表达上调,T组p-Smad2表达上调;T与E组均见凋亡,TE组凋亡加剧。结论:单用EGF不能诱导RLE-6TN发生EMT,合用TGF-β1无协同诱导EMT,却能协同诱导凋亡。TGF-β1诱导EMT时,主要通过EGFR信号通路诱导MMPs表达。     

qPCR检测全反式维甲酸对人胚肺成纤维细胞α-SMA基因表达的影响

采用体外培养人胚肺成纤维细胞(HFL-I)的方法,应用qPCR技术检测全反式维甲酸(ATRA)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人胚肺成纤维细胞中α-SMA基因表达的影响.实验分为正常对照组、5μg/L TGF-β1组、10μmol/L ATRA组、5μg/L TGF-β1+0.1μmol/L ATRA组、5μg/L TGF-β1+1μmol/L ATRA组和5μg/L TGF-β1+10μmol/L ATRA组(TGF-β1和ATRA同时加入).处理24h后检测结果显示:与对照组细胞相比,TGF-β1诱导HFL-I中α-SMA基因表达明显上调(6.36倍).不同浓度ATRA干预后均可以明显抑制TGF-β1诱导的HFL-I中α-SMA基因表达(分别为正常组的3.89、1.94和1.42倍).以上结果表明,ATRA可以明显抑制TGF-β1诱导的α-SMA基因表达.ATRA对HFL-I细胞增殖和TGF-β1诱导分化的抑制作用可能是通过下调α-SMA基因表达实现的.     

TGF-β通过调控线粒体功能影响肺癌细胞的侵袭和迁移

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)在诱导肺癌细胞上皮-间质转化(EMT)的模型中对线粒体的影响与机制，以及线粒体功能受损对EMT的作用。方法:在TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT的模型中，利用流式检测线粒体膜电位及活性氧(ROS)水平，通过RT-PCR检测线粒体相关基因的表达；通过转化生长因子-β受体(TGF-βR)抑制剂和构建Smad2敲除的A549细胞，结合流式和RT-PCR手段验证TGF-β对线粒体调控的通路；利用RT-PCR和报告基因实验分析TGF-β对线粒体调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(PGC-1α)的影响；通过构建A549-tet-PGC-1α细胞检测PGC-1α诱导过表达对线粒体基因表达的影响；构建PGC-1α诱导敲低的A549细胞株，结合Western blot、RT-PCR、损伤修复和细胞迁移等实验分析PGC-1α敲低对细胞EMT的影响。结果:TGF-β显著促进线粒体膜电位(P<0.05)和ROS(P<0.001)水平，并抑制线粒体相关基因的表达(P<0.001),而TGF-βR抑制剂及Smad2敲低可抑制TGF-β引起...     

CTGF反义寡核苷酸对体外培养人晶状体上皮细胞转分化的影响

目的:研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)反义寡核苷酸对体外培养人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)合成CTGF与а-SMA表达的影响。方法:测算CTGF反义寡核苷酸对体外培养HLECs的转染率;应用CTGF反义寡核苷酸直接转染第三代HLECs进行细胞生长曲线的测定;采用RT-PCR检测细胞CTGF和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA水平。结果:直接导入法反义寡核苷酸进入较慢,但导入72h后未出现细胞毒性。CTGF反义寡核苷酸直接导入HLECs培养细胞72h后可见对细胞增殖的抑制作用。直接导入法处理48h后,TGF-β1能显著增加CTGF以及α-SMA mRNA的表达,但却可被CTGF反义寡核苷酸所抑制。而错义寡核苷酸却没有这种作用。结论:CTGF反义寡核苷酸直接转染HLECs能抑制TGF-β1诱导的CTGF与α-SMA表达上调,提示CTGF反义寡核苷酸可能为防治后发性白内障提供新途径。     

香青兰总黄酮调控Notch1信号通路对ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的研究香青兰总黄酮(TFDM)对大鼠血管平滑肌A7R5细胞表型转化的影响,探讨其用于动脉粥样硬化治疗的可能机制。方法实验分为6组,分组如下:ox-LDL刺激A7R5细胞表型转化作为模型组;用浓度分别为25、50、100μg·mL~(-1)TFDM处理表型转化的细胞作为低、中、高剂量组; 10~(-5)mol·L~(-1)辛伐他汀处理表型转化的细胞,作为阳性对照组;未经处理的细胞作为正常对照组。采用CCK-8法测定细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。蛋白免疫印迹测定SM22α,α-SMA和Notch1通路相关蛋白Notch1、actived-Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5蛋白的表达。结果与ox-LDL刺激的模型组比较,高剂量的TFDM刺激细胞后显著降低其增殖、迁移能力(P0.001或P0.05),上调SM22α,α-SMA表达(P0.05),下调Notch1、actived-Notch1、RBP-Jκ、Hes-1及Hes-5的表达(P0.001,P0.01或P0.05);中、低剂量的TFDM对细胞增殖、迁移及相关蛋白表达也有相应的调节,但作用不如高剂量显著。结论TFDM能显著抑制ox-LDL诱导A7R5细胞的过度增殖、迁移及表型转化,这种作用可能与调节了Notch1信号通路有关。     

HIF-1α对宫颈癌细胞迁移能力的影响

将表达野生型HIF-1α(fl HIF-1α)和抑制性HIF-1α(dn HIF-1α)的重组质粒pcDNA3.1-fl HIF-1α和pcDNA3.1dn HIF-1α转染入SiHa细胞中表达,采用免疫细胞化学法和Western blot检测重组质粒转染SiHa细胞后其HIF-1α与CXCR4表达水平的变化;划痕试验测定细胞迁移情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果重组质粒pcDNA3.1fl HIF-1α和pcDNA3.1dn HIF-1α转染SiHa细胞后,pcDNA3.1-fl HIF-1α转染组(fl组)HIF-1α蛋白表达水平与其他三组比显著增高,差异具有统计学意义(P＜0.05),而pcDNA3.1dn HIF-1α转染组(dn组)与pcDNA3.1组和未转染组相比无统计学差异(P＞0.05).但fl组和dn组其CXCR4蛋白水平的表达与pcDNA3.1组和未转染组相比均有较明显的差异(P＜0.05).fl组迁移能力略高于对照组(P＞0.05),dn组迁移能力明显低于对照组(P＜0.05).HIF-1α能提高CXCR4蛋白的表达,从而加快SiHa细胞的迁移;而dn HIF-1α的作用正好相反.     

Rho信号通路抑制剂Y27632抑制TGF-β诱导的MCF-7细胞上皮间质转化

许多研究表明在乳腺癌的发生过程中上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)起到十分重要的作用,转化生长因子–β(transforming growth factor-β,TGF-β)是公认的可以引起EMT的重要因子,在EMT过程中涉及许多信号通路,但是Rho信号通路在其中的作用尚未报道.本文首先建立TGF-β诱导人乳腺癌细胞MCF-7上皮间质转化的模型,利用划痕实验检测细胞迁移能力,利用实时定量荧光PCR(real-time PCR)和免疫印迹(Western blot)实验检测间质标志基因的表达情况.进一步通过加入Rho通路抑制剂Y27632研究Rho通路在TGF-β诱导的MCF-7细胞EMT中的作用,结果证实TGF-β可以诱导MCF-7细胞EMT,促进MCF-7细胞迁移,而Y27632抑制TGF-β诱导的MCF-7细胞EMT过程及其迁移.     

TGF-β1在人前列腺上皮细胞炎症过程中的表达机制及意义

目的:探讨炎症刺激诱导人前列腺上皮细胞中转化生长因子(TGF-β1)的表达水平,分析其影响机制及意义.方法:采用脂多糖诱导处理人前列腺上皮P69细胞构建炎症细胞模型,体外培养正常P69细胞(对照组)和炎症细胞(实验组)至对数生长期,运用酶联免疫法检测两组细胞中白细胞介素-6(IL-6)、IL-10和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的质量浓度.分别利用qPCR法和Western Blot法检测两组细胞中c-Myb和TGF-β1的mRNA表达和蛋白定量水平;应用Real time PCR测定两组细胞中hsa-miR-150的表达;采用hsa-miR-150-mimic和hsa-miR-150-inhibitor分别处理两组细胞,qPCR法和免疫荧光法观察c-Myb及TGF-β1的表达水平改变;采用c-Myb抑制剂处理后,观察两组细胞中TGF-β1的表达程度.结果:实验组IL-6、IL-10和TNF-α水平均较对照组明显升高(P0.05),表明P69炎症细胞模型构建成功.实验组c-Myb和TGF-β1的蛋白表达水平较对照组增强;基线状态下实验组细胞hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表达水平均高于对照组(P0.05);hsa-miR-150-mimic处理后,实验组hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表达水平与处理前比较无统计学差异(P0.05),对照组hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表达水平较处理前水平升高(P0.05),免疫荧光显示对照组c-Myb和TGF-β1的蛋白表达水平均高于实验组;hsa-miR-150-inhibitor处理后,实验组hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1水平较处理前明显降低(P0.05),对照组hsa-miR-150、c-Myb和TGF-β1的mRNA表达水平与处理前比较无统计学差异(P0.05),处理后两组间hsa-miR-150的mRNA表达结果比较无统计学差异(P0.05),而两组间c-Myb和TGF-β1的mRNA表达水平分别比较均具有统计学差异(P0.05),免疫荧光显示对照组c-Myb和TGF-β1的蛋白表达水平均低于实验组;c-Myb-inhibitor抑制处理前,两组细胞TGF-β1的mRNA表达水平存在显著性统计学差异(P0.05);处理后,实验组TGF-β1的mRNA表达水平较处理前出现降低,对照组表达水平与处理前比较无统计学差异;两组间表达水平存在统计学差异(P0.05),实验组较对照组表达水平高.结论:人前列腺上皮细胞在炎症刺激下可引起hsa-miR-150表达升高,进而激活下游靶向因子c-Myb,最终诱导TGF-β1表达升高.     

口服蛋氨酸造成的大鼠肾间质纤维化模型及其机制研究

目的:研究口服蛋氨酸造成的大鼠肾间质纤维化模型及叶酸的治疗作用,同时观察同型半胱氨酸对人近曲小管上皮细胞增殖的影响,并初步探讨其机制。方法:24只普通SD大鼠随机分成三组,分别灌以双蒸水,蛋氨酸,蛋氨酸+叶酸,120天后处死大鼠,测定血浆同型半胱氨酸浓度,观察肾间质纤维化程度及检测组织中E-钙连接蛋白的表达;同时培养人近曲小管上皮细胞,观察同型半胱氨酸单独处理及叶酸联合处理后细胞的增殖情况及α-平滑肌肌动蛋白、E-cad的表达。结果:(1)蛋氨酸组血浆同型半胱氨酸水平较对照组显著升高,肾间质出现一定程度的纤维化,组织中E-cad的表达显著下调。(2)细胞中E-cad的表达显著下调、α–SMA的表达显著增高,细胞增殖明显。(3)叶酸治疗能显著减轻蛋氨酸所致的高同型半胱氨酸血症和肾间质纤维化,上调E-cad的水平,降低α-SMA的表达,抑制细胞的增殖。结论:通过口服蛋氨酸促发高同型半胱氨酸血症能诱导肾间质纤维化,其机制可能与肾小管上皮细胞的异常增殖及肾小管上皮转分化有关;叶酸能对抗这一作用。     

桔梗抗MP有效部位对TGF-β1 mRNA表达的影响

探讨桔梗抗肺炎支原体(MP)有效部位对感染大鼠肺组织中TGF-β1 m RNA表达的影响.采用滴鼻法构建肺炎支原体肺炎大鼠模型,用光学显微镜观察大鼠肺组织形态学的变化,运用RTPCR法检测TGF-β1在空白对照组、模型对照组、阿奇霉素组、桔梗有效部位高、中、低剂量组的表达情况.结果表明,空白组大鼠的肺组织结构正常,模型组大鼠的肺组织呈重度或中度炎症病变,造模成功,给药各组大鼠的肺组织病变均有所改善.模型组大鼠肺组织中TGF-β1 m RNA的表达量明显增多,桔梗抗肺炎支原体有效部位高、中、低剂量组和阳性药组均能下调感染MP大鼠肺组织中TGF-β1的表达,其中阿奇霉素组和桔梗有效部位高剂量组效果最佳.桔梗有效部位对MP感染致大鼠肺损伤的修复作用机制可能是通过下调TGF-β1,抑制了上皮间质转化的过程.     

组蛋白乙酰转移酶p300对人乳腺癌细胞迁移的影响

在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染p300表达质粒过表达p300,及利用si RNA干扰技术下调p300的表达,以此研究组蛋白乙酰转移酶p300对肿瘤细胞迁移的影响.体外细胞划痕实验表明,过表达p300可以促进MDAMB-231细胞的迁移.RT-PCR和免疫印迹实验(Western blot)结果表明,过表达p300导致肿瘤迁移相关基因MYL9、CYR61和MYH9的m RNA和蛋白表达水平的上升.与过表达p300相反,干扰p300的表达引起肿瘤迁移相关基因MYL9、CYR61和MYH9的m RNA和蛋白表达水平的下调.     

PM2.5对人肝星状细胞增殖、迁移的影响及机制研究

目的:研究大气细颗粒物PM_(2.5)对人肝星状细胞LX-2增殖、迁移的影响,并探讨其活化LX-2的机制.方法:将LX-2细胞随机分为对照组、不同质量浓度PM_(2.5)染毒组(终质量浓度分别为5、10和20μg/mL)和PM_(2.5)+TGF-β1受体抑制剂SB525334组.用CCK-8法检测细胞的增殖情况,用Transwell法和划痕法观察细胞的迁移变化,用RT-PCR法和ELISA法分别从基因和蛋白水平检测TGF-β1的表达情况.结果:CCK-8实验和迁移相关实验显示PM_(2.5)染毒后LX-2细胞的增殖能力和迁移能力明显增强,与对照组差异显著(P0.05).RT-PCR结果显示PM_(2.5)染毒后TGF-β1基因表达上调,ELISA结果显示PM_(2.5)染毒后细胞培养上清中TGF-β1质量浓度明显增高,与对照组差异显著(P0.05).结果还显示PM_(2.5)+TGF-β1受体抑制剂SB525334组LX-2细胞的增殖和迁移均得到明显抑制,与PM_(2.5)组比较有统计学意义(P0.05).结论:PM_(2.5)可通过诱导TGF-β1分泌来活化人肝星状细胞,使细胞增殖、迁移能力增强,这可能与其所致肝纤维化毒性相关.     

TGFβ1 shRNA对293细胞合成TGFβ1的干扰作用

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对293细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗方法提供技术基础和依据.方法:针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1 shRNA和TCFβ1基因的绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空质粒组为对照,通过脂质体包裹分别转染293细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TGFβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后293细胞TGFβ1mRNA表达量,转染后24、48和72 h TCFβ1shRNA质粒组TCFβ1mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.2%、97.1%和67.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染293细胞后24、48和72 h TGFβ1shRNA均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

二甲双胍通过调控STAT3的表达抑制头颈部肿瘤转移机制的研究

探讨二甲双胍是否通过调控STAT3的表达抑制头颈部肿瘤的EMT和迁移.在头颈部肿瘤686LN细胞株上给予二甲双胍处理,Western blot检测上皮-间叶样转化(EMT)相关蛋白的表达;通过Transwell实验检测二甲双胍对头颈部肿瘤细胞迁移能力的影响;在高转移特性的头颈部肿瘤细胞株和配对的低转移特性的细胞株上,检测STAT3蛋白表达;用脂质体转染STAT3的小干扰RNA,检测头颈部肿瘤EMT相关蛋白的表达;在686LN上给予IL-6处理或者给予二甲双胍处理或者同时给予IL-6和二甲双胍处理,检测STAT3蛋白和EMT相关蛋白表达;以及通过Transwell实验检测二甲双胍对IL-6诱导的细胞迁移的影响.结果显示,给予二甲双胍处理,抑制头颈部肿瘤的EMT,并且细胞迁移能力减弱. STAT3磷酸化和总蛋白在高转移特性的头颈部肿瘤细胞株高表达.转染STAT3 siRNA抑制STAT3的表达可抑制头颈部肿瘤的EMT.二甲双胍抑制IL-6介导的STAT3磷酸化水平升高,抑制IL-6诱导的EMT,同时二甲双胍抑制IL-6诱导的细胞迁移.结论说明,二甲双胍抑制头颈部肿瘤EMT和细胞迁移,并且能抑制IL-6介导的STAT3磷酸化水平升高,其抑制头颈部肿瘤迁移作用机制可能与下调STAT3的磷酸化水平有关.     

CCL18与TGF-β促进乳腺癌EMT的比较

目的:研究比较CCL18与β转化生长因子(TGF-β)促进乳腺癌细胞上皮间质化(EMT)的分子机制,从而进一步明确靶向CCL18和TGF-β所激活的信号通路,抑制乳腺癌浸润迁移的分子靶点.方法:设计并合成针对CCL18的受体基因PITPNM3的特异性siRNA,利用脂质体携带siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,沉默PITPNM3的表达,分别用CCL18和TGF-β处理乳腺癌细胞,用免疫荧光和western blot的方法检测EMT的特异性标志物E-cadherin和Vimentin表达的变化以及Smad2和Smad3的磷酸化状态.结果:PITPNM3-siRNA转染MCF-7细胞24 h后,用CCL18或TGF-β分别处理乳腺癌细胞4 d,western blot证明CCL18不能磷酸化激活Smad2和Smad3,TGF-β磷酸化激活Smad2和Smad3促进乳腺癌EMT,沉默PITPNM3表达,western blot和免疫荧光证明不影响TGF-β促进乳腺癌EMT.结论:TGF-β通过Smad2/smad3磷酸化激活促进乳腺癌EMT,不通过CCL18的受体PITPNM3发挥作用.     

甲泼尼龙对单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化的影响

为探讨甲泼尼龙在小鼠肾纤维化中的作用,本文通过单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)实验建立肾纤维化模型。实验将25只雄性Balb/c小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。手术后第2天给药,14 d后,使用HE染色和Masson染色检测各组小鼠肾脏病理变化情况。Western blotting和IHC染色检测各组梗阻侧肾脏中Col-1、Col3A1、FN、α-SMA的表达情况以及TGF-β/Smad和NF-κB信号通路中蛋白的表达情况。结果显示UUO会导致小鼠肾间质纤维化,甲泼尼龙能显著减弱UUO小鼠肾间质细胞外基质Col-1、Col3A1、FN、α-SMA的生成,下调TGF-β/Smad和NF-κB信号通路中蛋白的表达。由此可知,甲泼尼龙对小鼠肾纤维化有明显的改善作用,它通过抑制TGF-β/Smad和NF-κB信号通路来减轻UUO诱导的肾纤维化。     

康复新液对转化生长因子-β1诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5纤维化模型的干预作用

为探讨康复新液对人胚肺成纤维细胞纤维化模型的干预作用,以转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5构建细胞纤维化模型,并运用CCK-8(cell counting kit-8)法检测康复新液对MRC-5细胞的毒性.以测得的最高不致死给药浓度(80倍稀释)的康复新液干预TGF-β1诱导的MRC-5细胞模型,进而通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(WB)检测细胞纤维化指标的mRNA及蛋白质表达水平变化.结果显示:10ng/mL TGF-β1可成功诱导MRC-5细胞发生纤维化,且细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、层黏连蛋白(laminin,LN)、纤维连结蛋白(fibronectin,FN)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)的mRNA表达水平均显著升高;以80倍稀释的康复新液为最高不致死给药浓度,对MRC-5细胞纤维化模型进行干预,上述纤维化指标的mRNA及蛋白质表达水平均出现显著下降,与地塞米松(Dexamethasone,DXM)的干预效果相当.综上,康复新液可改善由TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化的表型,有望被应用于肺纤维化的治疗.     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪,构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒,并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞,包装成有活性的慢病毒,收取病毒感染 A549 细胞,利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞,通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化,发现在 TGF-β 诱导 48 h 后,A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞,诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗,同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系,为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.     

蜜环菌β-1,6-葡聚糖通过调节人源巨噬细胞极化发挥抑制结肠癌作用

以人源巨噬细胞THP-1诱导的M2型巨噬细胞为模型， 研究从蜜环菌中分离纯化出的β-1,6-葡聚糖(AAMP-A70)对其极化影响， 并分析AAMP-A70通过调节巨噬细胞极化抑制结肠癌细胞DLD-1增殖的作用及机制. 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时荧光定量PCR(qRT-PCR）检测AAMP-A70处理前后THP-1诱导的M2型巨噬细胞中M1型和M2型巨噬细胞标志物表达情况;  将各处理组的细胞培养液处理DLD-1细胞， 通过MTT和结晶紫染色检测DLD-1细胞的增殖情况；  并通过Western-blot实验检测DLD-1细胞的凋亡蛋白表达情况. 实验结果表明： AAMP-A70可显著下调M2型巨噬细胞标志物VEGF，Arg-1，TGF-β的表达， 促进M1型巨噬细胞标志物TNF-α,IL-1-β,CCR7的表达;  AAMP\|A70处理组细胞的培养液可显著抑制DLD-1的增殖， 且呈浓度依赖趋势;  AAMP-A70处理组的细胞上清液可诱导DLD-1细胞中表达的cleaved-PARP和 cleaved-Caspase-3上调.