RUVBL2基因knock-down对Rad51和γ-H2AX foci的影响

用脂质体转染的方法将特定的RUVBL2 si RNA序列转染到真核细胞,并鉴定其在人肺纤维细胞(MRC5 SV)中的表达,以确保RUVBL2基因的knock-down效果。用Rad51和γ-H2AX的特异性抗体进行免疫荧光染色,应用荧光显微镜观察计数Rad51和γ-H2AX foci的数量。Western blot法证实了si RNA以及转染的效率,确定了RUVBL2基因的存在有利于诱导DNA双链断裂(DSB)条件下Rad51和γ-H2AX被招募到DNA损伤位点。     

新一代基因组编辑技术在人类疾病动物模型中的应用

基因编辑是一项对基因组进行定点修饰的新技术。基因编辑主要通过对目的基因的改造,达到未知功能基因研究和疾病治疗的目的。近年来,人工核酸酶介导的锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)及RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas RGNs)等新一代基因组编辑技术的兴起极大地推进了基因功能研究的进展,并在构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案方面有着重要的意义。本文就这3种基因编辑技术及其在人类疾病动物模型研究中的应用作一介绍。     

人工核酸酶介导的基因靶向修饰技术

基因组靶向修饰技术是基因组改造和基因研究的重要手段,而人工核酸酶介导的基因修饰技术很大程度上提高了基因组靶向修饰的有效性、高效性和特异性,其主要工作原理是造成特异性的DNA双链断裂(DSB)诱导细胞内DNA修复,从而造成自发突变或引入人为变化,完成基因的敲入或者敲除.人工核酸酶基因修饰技术,包括了锌指核酸酶(ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术以及CRISPR-Cas系统,它们的分子作用机制、系统构建以及效用有一定的不同.对3种基因修饰技术的原理、研究进展和应用进行系统的阐述.通过利用人工基因修饰技术,能够精确、高效地对特定的基因实现编辑和修饰,以期在基因工程领域得到广泛的应用.     

利用CRISPR/Cas9技术制备Mindin基因敲除小鼠

针对Mindin基因编码序列设计3条单链向导RNA(sgRNA),制备相应质粒,将表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒共同电转入小鼠成纤维细胞L929中,通过药物筛选获得细胞库.经单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,选择效率最佳的sgRNA.体外转录获取sgRNA和Cas9mRNA,进行小鼠受精卵的显微注射后提取小鼠基因组DNA测序鉴定.产生的40只小鼠中17只发生不同程度的碱基插入或缺失,其中23号小鼠缺失10个碱基造成移码突变,Mindin基因表达被破坏,成功构建出Mindin基因敲除小鼠,为深入研究Mindin基因的生物学功能奠定了基础.     

原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用

CRISPR-Cas系统是新近在原核生物中发现的一种抵御外来DNA入侵的免疫机制,由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成,广泛分布于真细菌和古菌中.CRISPR由重复序列及其间隔序列组成,间隔序列来自于过去的入侵DNA,并插入到细菌的CRISPR排列中.一旦出现新的入侵,CRISPR转录,其RNA经过加工后与Cas蛋白质组成一个核蛋白复合体,该复合体通过RNA与入侵DNA序列之间的互补配对,结合目标序列,最后Cas蛋白质将入侵DNA降解.此外,基于CRISPR系统中的Cas9蛋白,发展了一种新的基因组编辑技术,在不同的细胞中均能获得高效的基因定点打靶,展现出巨大的潜力.     

基因编辑技术在绒山羊育种中的应用

近年来,随着基因编辑技术发展的日趋完善,其在猪、牛、羊等家畜育种上的应用日益增多.为全面了解基因编辑技术在绒山羊育种中的研究进展,总结了锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活类效应因子(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶(CRISPR/Cas9)三种基因编辑技术的原理和方法,阐述了其在转基因绒山羊研究中的发展现状和应用前景.     

位点特异性DNA内切酶在植物基因打靶中的应用

基因打靶是在基因组指定位点插入、删除和替换DNA序列的技术。由于同源重组频率低,在植物中高效的基因打靶技术一直未被建立,制约了植物基因功能和分子育种的研究。近年来,人工设计的锌指蛋白和TAL效应因子DNA结合结构域实现了对全新DNA序列的识别。人工设计的DNA结合结构域连接核酸内切酶能在基因组指定位点创造双链DNA断裂,进而产生定点突变和促进同源重组。笔者重点介绍锌指核酸酶和TAL效应因子核酸酶在植物基因组定点突变和基因打靶中的研究进展,并对目前存在的问题进行分析。     

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究

通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是目前应用最为广泛的基因敲除技术手段,但同源重组的效率却非常低.TALEs和FokI的剪切结构域融合的TALENs可以实现高效的基因敲除.已有报导表明,TALENs识别位点的DNA序列和长度,及间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率.但外源载体的导入方式及载体的形式(DNA或RNA)是否以及如何影响TALENs的打靶效率还不明确.用不同的转导方式将TALENs导入小鼠胚胎干细胞中,并检测TALENs切割识别位点的效率,实验发现Lipofectamine○R2000转染的TALENs比电转化能更高效地切割目的 DNA位点,而DNA质粒或体外转录的RNA表达的TALENs切割DNA位点的效率相近.数据表明,在应用TALENs进行基因敲除时,有必要选择合适的转导方式以提高突变效率.     

RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达.近年来,RNAi技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段.文中综述了该技术在医学研究中的应用.