融合蛋白TAT-p53-MTS的促细胞凋亡作用

本研究首先构建了融合蛋白 TAT-p53-MTS 的原核表达质粒 pET-22b(+)-TAT-p53-MTS,将表达纯化的融合蛋白与p53缺陷型人肺癌细胞NCI-H1299孵育,通过Western blot和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测融合蛋白的细胞穿膜以及与 Bcl-2蛋白的相互作用,并通过流式细胞术检测融合蛋白对 NCI-H1299细胞的促凋亡作用。结果显示,融合TAT和MTS的p53重组蛋白具有更强的细胞穿膜及线粒体定位能力;并且,融合蛋白能够通过与Bcl-2蛋白的结合显著诱导NCI-H 1299细胞的凋亡。     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

含RGD序列水蛭素嵌合抗栓剂的构建与表达

通过对水蛭素及一些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽类血小板聚集抑制剂结构与功能的分析,设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。嵌合体基因分别重组到表达载体pET-21a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制酶消化和DNA序列分析,证明两种重组质粒与设计完全一致。由于RGD-水蛭素嵌合基因上游连接了金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的信号肽序列,在IPTG诱导下两种嵌合分子都获得了分泌表达,表达产物主要集中在细胞周质空间。通过离子交换层析和凝胶过滤层分别对两种嵌合体蛋白进行纯化,纯化产物在Tricine-SDS-PAGE中都显示为单一条带。活性分析结果表明两种嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活力的同时,还呈现抗血小板聚集活性。     

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry融合蛋白进行纯化;通过MTT法探讨ELP-mCherry融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果 DNA测序结果 显示成功构建了ELP-mCherry原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry融合蛋白,通过ITC法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT结果 表明:在所有ELP-mCherry蛋白测试浓度下,HEK293T和NIH3T3细胞存活率接近或超过100％.结论 成功构建ELP-mCherry原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry融合蛋白,ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...     

酵母双杂交筛选与视黄醇结合蛋白有相互作用的蛋白质

为了研究视黄醇结合蛋白(RBP)在维生素A代谢调控中的作用和与相关疾病发生、发展的关系，以RBP作为诱饵基因构建了融合表达载体pGBKT7-RBP；在排除自身转录激活活性的基础上，与人肾脏cDNA预转库融合筛选(Pretransformed MATCHMAKER Lbraries)，经营养缺陷型和X-α-gal显色鉴定，从中筛选出三种与RBP有相互作用的新蛋白质，并从人睾丸cDNA库中克隆了这三个基因的全长序列。     

蛋白质及其水解物的分析应用

蛋白质是重要的生物高分子,具有催化、传输、运动、防御和调节等重要生理功能.本文介绍了蛋白质的功能特性、蛋白水解物的研究应用现状,展望蛋白质改性的应用前景.     

基于网络拓扑和多种生物信息融合的关键蛋白质识别算法

关键蛋白质的识别有助于了解细胞存活的基本需求,并为疾病治疗找到新方法,但是蛋白质自身携带着复杂的生物特性,仅依赖网络拓扑特性不能精准地判断其关键性.因此,提出一种新方法来提高识别关键蛋白质的准确率.首先,考虑网络拓扑特性以及蛋白质在不同亚细胞中的重要程度,定义了SNC方法;其次,利用蛋白质在亚细胞与复合物信息中的特性定义了SIDC方法;最后,通过融合网络拓扑结构和多源生物信息,提出了关键蛋白质识别算法CTB.在YDIP、YMIPS和Krogan数据集上利用精准率-查全率等多种评估方法进行实验,结果表明CTB算法提高了识别关键蛋白质的性能.     

测定饲料蛋白质含量的一种新方法

本文介绍一种测定各种饲料蛋白质含量的新方法—蛋白质水解茚三酮法。将标准蛋白和几种饲料样品加3％H_2SO_4,直接加热6小时,通过蛋白质水解产生的氨基酸与茚三酮反应的光吸收值,计算总蛋白量;与未水解的标样及饲料样品的甲醇提取液的茚三酮反应吸收值之差计算去游离氨基酸的纯蛋白质量。本法与凯氏氮素定量法无显著差异,与DAVID L·MARKKS报导的密封水解24小时的效果相同。     

BIA技术及其在蛋白质科学研究中的应用

生物大分子相互作用分析(BIA)技术可以实时观察分子问相互作用．本文简要阐述了该技术的基本原理及系统组成，以及在蛋白质科学研究中的应用．包括配体垂钓，蛋白质相互作用，蛋白质功能鉴定等．     

Expressions of Two Rice Mip Genes under Water Stres,Salt Stress and Exogenous ABA

ＥｘｐｒｅｓｉｏｎｓｏｆＴｗｏＲｉｃｅＭｉｐＧｅｎｅｓｕｎｄｅｒＷａｔｅｒＳｔｒｅｓ，ＳａｌｔＳｔｒｅｓａｎｄＥｘｏｇｅｎｏｕｓＡＢＡ＊ＺｈｏｕＺｈｉｑｉ（周志琦），ＬｉｕＱｉａｎｇ（刘强），ＫａｚｕｋｏＹａｍａｇｕｃｈｉＳｈｉｎｏｚａｋｉ＋，Ｈｉｒ...     

大豆蛋白质的溶出工艺研究

采用凯氏定氮法和Bradford法测定蛋白质含量,计算大豆浆液中大豆蛋白质的溶出率。通过对NaCO3浓度、料液比、浸泡时间和温度的改变优化大豆蛋白质的溶出条件。结果表明,在常温下最佳的浸泡条件为0.4%的NaCO3和16h的浸泡时间,根据对浆料蛋白浓度的要求选择适当的料液比,在50℃条件下浸泡时间减少到6h。     

BCG 65KD热休克蛋白的纯化

目的：研究卡介苗（BCG）65KD热休克蛋白的提纯方法。方法：BCG经37℃恒温振荡培养两周,42℃热休克处理2h,培养液经离心、抽滤、盐析沉淀、SDS-PAGE分离、电泳洗脱等步聚纯化。结果：提纯产物经SDS－PAGE分析,其电泳区带在65KD位置,经抑制试验表明具有较高抗原活性结论：流程方法简单、实用,有助于对IDDM的诊断及其深入研究。     

番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)成员外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白

应用South-western技术以番茄丛矮病毒组(tombusvirus)6种病毒为材料研究了它们的外壳蛋白对单双链DNA的结合作用。结果表明tombus-组6种病毒(PLCV,AMCV,CNV,CyRSV,PAMV,TBSV)的外壳蛋白及PLCV重组外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白,对单链DNA的结合能力远远超过双链DNA。这种结合作用可能与在tombus一组病毒外壳蛋白立体空间结构有关,因为当蛋白变性时结合作用大大降低。另外,一旦外壳蛋白与单链DNA发生相互作用,用4moL/L尿素或0.1％SDS在90°C水浴中难以洗掉。Tombus一组病毒外壳蛋白这种对单双链DNA的结合作用可能表明它们是一种参与病毒体内运输或调节复制的蛋白。     

生物化学实验"蛋白质沉淀反应与盐析作用"解析

该文针对生物化学实验蛋白质沉淀反应与盐析作用中一些学生不能科学解释的实验现象进行了详细分析.为学生更深刻地理解理论知识做了必要的铺垫,也为今后的教学提供了宝贵的参考资料.