诸葛菜EPSPS基因5’端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸—3—磷酸合成酶(5—enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶，植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(g1yphosate)的耐性．采用5’—RACE技术从诸葛菜(0rychophragmus violaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段．序列分析结果表明：该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性。其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassica napus)同源性最高为90％，与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)和水稻(Oryza sativa)的同源性分别为88％，81％，64％，62％和71％．     

中段密码子序列对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响

通过调整表达翻译肽链中段Asp—Pro—Pro三个氨基酸的密码子的序列，观察其对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响。用PCR方法分别在rhBMP4-m基因的5’端加上编码Asp-Pro—Pro酸水解肽的不同简并码序列，克隆入原核融合表达载体pRSET中进行诱导表达，SDS—PAGE分析，观察融合蛋白的表达效果。成功构建9个不同简并码序列的融合表达载体；经诱导表达分析，只有在两个脯氨酸的密码子均为CCG时，融合蛋白才能正常表达，说明改变表达肽链中段氨基酸密码子的碱基序列可以影响融合蛋白的表达效果。     

复苏植物牛耳草引导蛋白基因的克隆与表达

复苏植物生长在干旱频繁发生的特殊生境中,具有耐极端干旱的特性,是一种宝贵的耐旱基因资源植物．前期实验从复苏植物牛耳草的叶片中得到一个干旱诱导的细胞壁蛋白基因片段,在此基础上利用5＇-RACE获得全长cDNA,命名为BhDIRI,编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质,与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有20％-40％的序列相似性．表达分析表明BhDIRI在复苏植物牛耳草干旱复水过程中mRNA明显积累,激素、信号分子和温度胁迫都可诱导其表达．BhDIRl在N’端包含一个外泌的信号肽,GFP融合蛋白的荧光定位分析证实BhDIRl定位于细胞膜和壁上．根据牛耳草干旱后酸溶木质素含量下降这一现象及以上结果可推测,BhDIRl可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性,减少干旱对细胞造成的机械伤害．     

RLM-RACE法快速克隆盐角草胆碱单加氧酶cDNA 5′末端全序列

采用RLM-RACE法，根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列，设计2条特异性嵌套PCR引物，成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列，测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸，编码N端202个氨基酸，Blast P结果表明，该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85％以上，同时找出了其转录起始位点，即为该序列的第1个碱基g．     

水稻中一个与COI1同源的基因克隆及其表达分析

利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到了几条与拟南芥中的COI1基因具有高度同源性的EST(expression sequence tag)片段和相应的基因组序列．根据EST拼接和基因组比较结果设计引物,利用RT—PCR在水稻中得到与COI1高度同源的cDNA,并在基因组中推断出相应的基因,命名为RCOI1．RCOI1与COI1在氨基酸水平有74％的同源性．与COI1相似,RCOI1蛋白也具有典型的F—box和LRRs结构域．半定量RT—PCR显示该基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,说明这个基因可能参与水稻茉莉酸应答反应．该基因的发现对于探索单子叶植物的茉莉酸信号转导途径,以及研究该途径在农作物中的抗虫抗病和抵抗恶劣环境等方面的作用都有重要意义．     

人载脂蛋白基因apoAI在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAI基因插入分泌型载体pPIC9K．将重组的pPIC9K—apoAI用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子．转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rApoAI表达．经Phenyl—sepharose 6(Fast Flow)疏水层析柱和Sephadex G-50(coarse)分子筛层析，得到rApoAI蛋白纯品．经Western blotting，N末端氮基酸顺序测定证明，毕赤氏酵母表达的rApoAI与人血浆提取的ApoAI基本一致．     

盐生植物大米草PSⅡ颗粒的放氧活性及多肽组分

以盐生的大米草（Ｓｐａｒｔｉｎａａｎｇｌｉｃａ）为实验材料，ＢＢＹ法制备ＰＳⅡ颗粒，氧电极法测定其放氧活性，并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及盐洗等手段对其多肽组分及特性进行了探索．结果显示①大米草尽管生长在盐生的环境中，但其ＰＳⅡ放氧活性（９９．９２μｍｏｌＯ２／ｍｇＣｈｌ·ｈ）和菠菜接近，但比分类地位较接近的小麦要高出１倍．②外加ＣａＣｌ２后，大米草ＰＳⅡ放氧活性由原来的９９．９２μｍｏｌＯ２／ｍｇＣｈｌ·ｈ增加到１１４．２０μｍｏｌＯ２／ｍｇＣｈｌ·ｈ，表明Ｃａ２＋的数量和分布与放氧过程密切相关．③多肽组分分析表明，大米草ＰＳⅡ由１３条多肽组成，比中生类型的植物增加了分子量为６７０００和５００００的２两条多肽．④盐洗后，放氧活性降低，回加ＣａＣｌ２，放氧活性得到一定程度的恢复．多肽组分分析显示盐洗后，分子量为２４０００，１８０００及其它４条小分子多肽有不同程度丧失．这表明盐生大米草与放氧有联系的多肽和菠菜、小麦存在差异     

5″—核苷酸生产工艺

一母一一酵一浓盐抽提;10%工业食盐,托0℃,二小时…儿丫桔青霉一 】 伞一核酸提取液…pH=2.弓,沉淀核酸 C O 4….击丫斜。、培养基… {“8℃一30oC,48小时余,面菌种…{接种入三角瓶一三角瓶培养J_核糖核酸一 72小时2习℃一30oC棉床培养—、}.纱布上滤…—滤液为弓’一磷酸二醋酶一…稼}10%磷酸二醋酶液酶介,“。C一70℃,二小时0.弓一1%核糖核酸四种5混一核昔酸合液真空浓缩,700C,PH=6一7杏浓缩掖为原体积 十分之一 幸 5’一核昔酸浓缩液装瓶,高压杀菌(1公斤压力,1,分钟 伞 供农业大田试用 一 一l"一 一 一 一加入三倍体积工业酒精沉淀l…     

一个烟草PR-1a启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增，从烟草Nicotiana tabacum cv Samsun中克隆了水杨酸诱导表达的病程相关蛋白PR-la基因的启动子TP12，以期用于构建诱导表达基因敲除系统，并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。启动子的克隆产物经正反两向测序后，拼接分析结果表明，扩增得到的PR-1α基因启动子长1313个碱基，序列富含AT，其中A T占71．67％，与已报道的序列比较，核苷酸的相似性为98．6％。     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

盐胁迫下水稻和黑麦幼苗蛋白质组份的变化

耐盐的779水稻幼苗中,盐胁迫后诱导出66kD/P15\5和26kD/p16.0的特异蛋白组份,并有多种蛋白质组份消失和含量减少现象,而在盐敏感的早花2号水稻中,虽然也有少数蛋白质组份被诱导产生,但没有检测到66kD和26kD两种蛋白质组份,并且双向SDS－PAGE谱型相对稳定,一般耐盐的黑麦幼苗中经盐胁迫后也诱导出26kD蛋白组份,因此,66kD,26kD两种蛋白组份可能与耐盐性有关。     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列，并将其克隆到表达载体pET32a中，在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白，诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中，经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化，得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

盐胁迫下水稻、番茄蛋白质变化的电泳分析

水稻品种 90 1 7经盐胁迫后 ,分子量约为 45 KD蛋白质减少 ,约为 38KD蛋白质增加 ,同时出现了分子量与调渗蛋白相类似的 2 6 KD蛋白质 ,随着盐胁迫浓度的提高及胁迫时间的加长 ,上述蛋白质谱带变化更为明显 .番茄品种白果强丰经盐胁迫后其真叶中分子量约为1 4KD和 1 7KD蛋白质减少 ,同时诱导出一条分子量约为 2 2 KD的新带 .     

脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

目的筛选出脂肪酶活性较高菌株,通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶,根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法采用透明圈法,以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株;通过PCR扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列,构建pET-28 a表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达;通过Ni柱将脂肪酶纯化,并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株,16S rRNA基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp,其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%,PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD,该蛋白在55℃、pH 7.0时活性最高.结论通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上,且耐高温,为脂肪酶工业化应用奠定了基础.     

五种疟原虫红内期蛋白的SDS—聚丙烯酰胺电泳

本文用１％ＮＰ－４０提取五种疟的虫（间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、伯氏疟原虫、约氏疟原虫）红内期可溶性蛋白组分。各种蛋白提取物经ＳＤＳ－聚丙烯安电泳后氨银染色，所得蛋白图谱经光密度扫描进行分析。实验结果表明五种疟原虫蛋白区带数目及位置各不相同，但两条分子量分别为７２ＫＤ和６４ＫＤ蛋白为五种疟原虫共有区带。在五种疟原虫中，以伯多疟原虫与约氏疟原虫蛋白谱最类似，表明二者种间进化关系较接近。     

豇豆种子萌发进程中蛋白质组分的时空变化

以豇豆品种(早翠和矮虎)为材料,通过SDS-PAGE技术获得3个时期(干种子期、吸胀期、发芽期)和2个部位[胚(胚芽、胚根和胚轴)和子叶]的3种蛋白质组分(水溶、盐溶和碱溶)的电泳图谱.结果表明:品种间条带分布差异最大的时期是干种子期,部位是胚,组分为盐溶蛋白质.在萌发进程中,相对分子质量为60.4KD、55.4KD和49.7KD的3个条带没有时空变化,推测其是豇豆的保守性蛋白或结构蛋白.组分中以水溶蛋白所显条带数居多,但品种间多态性不丰富,早翠有两个特异带,而矮虎仅一个;盐溶蛋白组分所显品种间条带多态性丰富,早翠有107.8KD、18.3KD、15.7KD、14.0KD、12.8KD和11.4KD6个特异带,矮虎有41.0KD、27.3KD和14.4KD3个.故在豇豆种子萌发进程中,各蛋白质组分在品种内和品种间的时序和空间表达上,既显示出一致性又显示出差异性.由于对干种子期胚或子叶盐溶蛋白质组分的电泳分析,既显示品种遗传稳定性又能反映品种特异性,故均适宜于豇豆基因型判别,但基因型遗传关系分析宜以胚为材料,品种纯度检测宜用子叶为材料,不能两者混合取材,吸胀后的种子蛋白质组分分析不能反映基因型差异.     

上海四膜虫酚溶性染色质非组蛋白的研究

收集对数生长期的上海四膜虫，分离细胞核，制备染色质并以酚抽提制得酚溶性染以质非组蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得四膜虫酚溶性染色非组蛋白有六条明显的蛋白带，其表观量为８８ＫＤ，７９ＫＤ，７０ＫＤ，５２ＫＤ，３８ＫＤ，２４ＫＤ，与鼠肝酚溶性染色质非组蛋白具有明显的５条的分子量有显著的差异。     

拟南芥类结瘤素基因At1g01070的生物信息学分析

类结瘤素基因在非结瘤植物生长发育中承担着重要的功能,但仅少数基因的功能被鉴定.本研究对拟南芥类结瘤素MtN21(Medicago truncatula NODULIN 21)家族成员At1g01070进行了生物信息学分析及亚细胞定位验证.结果表明,At1g01070有两种可变剪切体,编码两种蛋白At1g01070.1和At1g01070.2,前者比后者在N端多47个氨基酸,它们的分子量分别为40KD和35KD,等电点分别为9.2和8.9;均含有2个MtN21蛋白的特征结构域EamA(药物/代谢物转运结构域),At1g01070.1比At1g01070.2多一个PLN00411结构域,且其靠近N端的EamA结构域较后者长;三级结构均由7个α-螺旋和一些不规则卷曲组成,分别含有10个和8个疏水跨膜区,均含13个磷酸化修饰位点,亚细胞定位预测主要定位在质膜;进化上,与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)亲缘关系最近;亚细胞定位结果显示At1g01070.1定位在质膜,与预测结果一致.推测At1g01070在植物体内可能参与物质运输.     

hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征

为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.