CML细胞抗原相关TCR Vα13／Vβ21和Vα18／Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法:利用RT-PCR和基因扫描分析1例CML患者外周血单个核细胞中的TCR Vα和Vβ基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα和Vβ亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点,寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果:该病人外周血T细胞表达18个TCR Vα和12个TCR Vβ亚家族,其中Vα13、Vα18、Vβ1和Vβ21亚家族呈寡克隆性。CDR3序列分析获得3个TCR克隆基因序列,分别为Vα13NJα49、Vα18NJα50和Vβ21NDβNJβ2.7。结论:获得1例CML病人外周血克隆性增殖αβ T细胞的3个TCR基因CDR3序列,提示病人可能存在与CML细胞抗原相关的Vα13/Vβ21或Vα18/Vβ21T细胞克隆。     

淋巴瘤白血病患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性

目的:了解B细胞淋巴瘤白血病(LL)患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性.方法:利用RT-PCR分别扩增3例LL患者外周血单个核细胞的 TC R Vβ 24个亚家族基因的CDR3,以了解患者各Vβ亚家族的利用情况,然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性.结果:患者中仅存在2～6个Vβ亚家族T细胞.基因扫描分析显示,2例患者外周血中的Vβ1 、Vβ 3或Vβ4亚家族出现克隆性增殖T细胞. 结论:LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应.     

正常脐血TCR Vα亚家族的分布和克隆性表达

目的:了解正常脐血中T细胞受体(TCR)Vα亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法:利用RT-PCR分别扩增10例正常脐血单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因,了解各Vα亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞的克隆性.9例健康成人外周血和T细胞株Jurkat作为对照.结果:正常脐血T细胞平均表达17.30±5.48个Vα亚家族,占全部家族的59.65%±18.89%,以Vα3,4,5,6,8,10,12,13,15,17,21和Vα25为多见,健康成人外周血T细胞则大部分表达Vα亚家族,Vα1,6和Vα13在脐血中的表达率高于健康成人对照组,而Vα14和Vα16的表达率则低于对照组.T细胞株Jurkat则仅表达Vα1亚家族.基因扫描显示10例脐血中有2例在Vα24和Vα28 T细胞出现寡克隆性,其余均为多克隆性.结论:脐血中TCR Vα亚家族T细胞分布存在倾斜性,绝大部分TCR Vα亚家族T细胞均呈多克隆性,极个别可出现寡克隆性.     

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的：了解慢性粒细胞白血病（CML）相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养（MLTC）方法，利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖，用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCRVtx亚家族基因的互补决定区（CDR3），了解各Vd亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果：经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vd谱系基因（1—14个亚家族），两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势；正常人外周血出现寡克隆增殖的Va5、Vα14亚家族T细胞。结论：CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。     

RNA干扰下调PPP2R5C对T-ALL TCR Vβ亚家族分布和克隆增殖的影响

目的:基于前期利用靶向PPP2R5C基因的小干扰RNA(PPP2R5C-siRNA)抑制白血病T细胞增殖的结果,进一步了解PPP2R5C-siRNA对T-ALL样本中TCR Vβ亚家族基因谱系及其克隆性增殖情况.方法:利用PPP2R5C-siRNA转染2例初发未治疗T-ALL病人外周血单个核细胞(PBMC),设无关序列对照组(SC)和空白对照组(NC);利用实时定量PCR检测PPP2R5C基因表达水平.利用RT-PCR扩增各组样本中24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区3(CDR3);阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,了解其Vβ亚家族T细胞克隆性.结果:PPP2R5C-siRNA处理后明显下调PBMC中PPP2R5C基因表达水平.2例初发T-ALL外周血中分别可检测到10和17个Vβ亚家族,多数Vβ亚家族T细胞为多克隆性,病例1中Vβ9和Vβ17为寡克隆性,而病例2中,Vβ14和Vβ16呈寡克隆性;经过RNA干扰处理后,TCR Vβ亚家族表达率降低,仅检测到3和4个Vβ亚家族,分别为Vβ2,Vβ3,Vβ16和Vβ17.其中2个Vβ家族的寡克隆性模式发生改变,病例1中,Vβ17转为多克隆,而病例2中,Vβ16也转变为多克隆.结论:RNA干扰下调白血病T细胞PPP2R5C基因表达抑制细胞增殖时,在一定程度上影响TCR Vβ亚家族T细胞增殖和克隆模式变化,对正常T细胞功能可能存在一定影响.     

淋巴瘤白血病患者TCRVβ亚家旆T细胞的分布及其克隆性

目的：了解B细胞淋巴瘤白血病（LL）患者TCRVβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法：利用RT－PCR分别扩增3例LL患者外周血单个核细胞TCRVβ24亚家族基因的CDR3，以了解患者的Vβ亚家族的利用情况，然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的GDR3长度，了解T细胞克隆性。结果：患者中仅存在2－6个Vβ亚家族T细胞。基因扫描分析显示，2例患者外周血中的Vβ1、Vβ2或Vβ4亚家庭出现在隆性增殖T细胞。结论：LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞，这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应。     

NB4和HL - 60细胞诱导的脐血T细胞TCR Vβ基因谱系分析

目的：了解经NB4细胞和HL-60细胞体外诱导后脐血T细胞的TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞／肿瘤细胞培养（MLTC）方法,用经丝裂霉素灭活的NB4细胞和HL-60细胞体外诱导脐血T细胞增殖,利用RT-PCR分析经MLTC前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族的利用情况,并用基因扫描分析其克隆性特点。结果：诱导前脐血T细胞表达20个TCR Vβ亚家族,诱导后的T细胞所表达的TCR Vβ亚家族随培养时间增加而逐渐减少,且诱导组呈现出克隆趋势或寡克隆增殖特点。两种细胞诱导后10d均可见Vβ1的克隆增殖出现变化,此外,NB4诱导的T细胞出现Vβ15,而HL-60诱导的T细胞则出现Vβ23的克隆增殖情况。结论：NB4细胞和HL-60细胞可诱导脐血TCR VβT细胞克隆性增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与特异性抗原介导的细胞免疫反应有关。     

肿瘤患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞TCR Vβ基因克隆化分析

目的探讨肿瘤患者T细胞抗原受体(TCR)Vβ基因克隆化改变特征.方法应用多引物巢式PCR技术检测肿瘤患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的克隆化改变,与正常对照组比较,分析肿瘤患者TCR单克隆改变的特点.结果 CD8+T细胞TCRVβ基因亚家族单克隆改变的数量多于CD4+T细胞;肿瘤患者的CD4+T细胞中,只有Vβ2,Vβ7和Vβ8三个亚家族单克隆改变高于正常对照组(P0.01或P0.05),其他Vβ亚家族单克隆改变与正常对照组无明显差异.肿瘤患者的CD8+T细胞中,有14个Vβ亚家族单克隆改变均高于正常对照组(P0.01或P0.05);4组肿瘤患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR Vβ7亚家族的单克隆改变均明显高于正常对照组(P0.01或P0.05).结论通过检测TCR Vβ基因克隆化改变,可以初步了解T细胞对肿瘤的免疫应答状况.     

AML患者外周血中TCR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的检测

目的：检测急性髓性白血病（AML）患者外周血中CR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的存在情况。方法：利用半巢式PCR扩增31例不同亚型AML患者外周血单个核细胞DNA中TCRB基因重排时形成的T细胞受体DNA删除环（sjTRECs）中的Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs,10例正常人外周血作为对照。结果：TCR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人和AML患者中均可检测到,AML患者三者的检出率分别为45．16％、41．94％和32．26％,均略低于正常人,但差别未显示出统计学意义。≤30岁的AML患者3种Vβ sjTRECs的检出率均高于30岁以上的患者,以Vβ2-Dβ1sjTRECs最明显。结论：率先提供AML患者外周血T细胞中TCR Vβ2-、Vβ5-和Vβ17-Dp1 sjTRECs的存在情况,为研究AML患者胸腺近期各Vβ亚家族幼稚（naive）T细胞的输出情况提供资料。     

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA).分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2<'-△△Ct>分析TCRζ链表达差异.结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降.结论:超抗原SEA联合PML-RAR α多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点.     

急性早幼粒细胞白血病病人外周血TCR Vβ亚家 …

近年国外报道利用Ｔ细胞受体（ＴｈＲ）β基因的可变区（Ｖβ）２４个亚家族的特点,分析肿瘤或自身免疫性疾病病人中各 ＴＣＲ Ｖβ亚家族Ｔ细胞的表达情况,从而更为深入地了解病人的细胞免疫功能状态,并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的资料［１,２］。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ方法分析６例急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）病人Ｖβ亚家族Ｔ细胞的表达情况。１材料与方法 （１）材料：经细胞形态学和细胞化学检查等角诊的初发ＡＰＬ病人６例。收集治疗前病人外周血并分离单个核细胞（用淋巴细胞分离液按常规方法进行）。 （２）…     

CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选

为构建靶向T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于p X458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染Hep G2细胞系,用流式细胞术检测转染效率;转染48 h后提取Hep G2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变;对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因组PCR产物测序分析发现,S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰;T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24.2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.     

SLE患者外周血γδT细胞系的建立及表型和功能的研究

目的:建立体外扩增系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血γδT细胞的方法,并初步分析其表型和功能,探索γδT细胞在SLE发病中的作用。方法:采用单克隆抗体固相法,对15例SLE患者和8例正常人外周血γδT细胞进行体外扩增建系,以流式细胞仪检测γδT细胞表型,并用MTT法观察γδT细胞对Daud i细胞的细胞毒作用。结果:建立了SLE患者外周血γδT细胞系,其平均纯度为(58.1±11.2)%,较正常对照组(80.3±9.2)%偏低(P<0.05);其细胞表型为:Vδ1(34.4±24.5)%、Vδ2(61.9±28.6)%、Vδ3(16.1±10.6)%、Vγ9(76.4±11.8)%,其中Vδ2表达较对照组降低,而Vδ1和Vδ3表达增加(P均<0.05);其细胞毒作用在二组间无明显差别。结论:SLE患者外周血γδT细胞的Vδ、Vγ基因的取用表达存在差异,提示其在SLE的发病中可能起一定作用。     

流式细胞术检测TcR Vα24/Vβ11双阳性NKT细胞及其在HCV感染者中的应用

目的 研究丙肝病毒感染者外周血NKT细胞含量与HCV感染状态之间的相关性.方法 应用流式细胞术检测TcR Vα24/Vβ11双阳性NKT细胞.结果 抗-HCV阳性且HCV RNA也阳性的病例NKT细胞数量明显低于抗-HCV阳性而HCV RNA阴性的病例(P<0.01),明显低于正常对照组(P<0.05).结论 由于NKT细胞数量减少或活化受阻,造成HCV的持续感染,不利于病毒的清除;另一方面,由于肝内有HCV的存在,NKT细胞大量向肝内趋化,导致外周血的数量相对减少.     

肿瘤患者自体CIK细胞治疗及其对患者免疫功能的影响

目的　从恶性肿瘤患者外周血中高效诱导扩增CIK细胞并观察自体CIK过继免疫治疗对患者免疫功能的影响.方法体外利用抗CD3单抗、IL 2、γ IFN等细胞因子从12例肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增CIK细胞,分3次自体回输;并用流式细胞仪检测回输前后患者T细胞亚群和NK细胞变化.结果　CIK细胞经13d培养后细胞总数和CD3+CD56+T效应细胞均获得大量增殖,分别平均增殖123(46～301)倍和1656(177～5130)倍.肿瘤患者经自体CIK细胞免疫治疗后,CD3、CD4T细胞和NK细胞比例均显著提高(P<0.01).结论　可从不同恶性肿瘤患者PBMC中高效诱导扩增CIK细胞;自体CIK细胞过继免疫治疗可以显著提高患者免疫功能,且副作用小,具有良好的应用前景.     

淋巴细胞白血病患者CD3基因表达模式的变化

目的:了解T细胞受体信号传导分子CD3γδεζ基因在T和B细胞白血病病人中的表达特点.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测32例淋巴细胞肿瘤病人:急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)12例、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)9例、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)11例及10例健康人外周血...     

SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞体外诱导脐血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:常规分离4例脐带血单核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48 h后收集各组细胞提取mRNA并合成cD-NA,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算TCRζ链表达差异倍数。结果:抗CD3单抗组、K562细胞组、SEA组、SEA联合K562细胞组诱导培养T细胞中TCRζ链表达差异倍数分别是(4.52±0.96)、(1.65±0.26)、(1.43±0.44)、(3.41±0.30),表明各组均有活化T细胞的作用,但各组TCRζ链表达水平有差异,其中SEA联合k562细胞组的T细胞ζ链基因表达均明显高于单纯k562组及单纯SEA组(P0.01)。结论:超抗原SEA有助于增强K562细胞体外诱导T细胞活化作用。     

流式细胞术检测拉米夫定对慢性乙型肝炎患者T细胞亚群的影响

目的研究拉米夫定对慢性乙型肝炎（CHB）患者细胞免疫功能的影响.方法采用流式细胞术检测50例CHB患者在服用拉米夫定前后外周血T细胞亚群,同时检测45例健康体检者外周血T细胞亚群作为对照.结果CHB患者在使用拉米夫定后,CD4 T细胞百分比较使用前明显升高（P〈0.05）,CD8 T细胞百分比明显下降（P〈0.05）,CD4/CD8明显升高（P〈0.05）.结论拉米夫定可改善CHB患者的细胞免疫功能.     

IFN-α治疗对慢性丙型肝炎患者CD8~+T细胞亚群Tim-3表达水平的影响

为探讨应用IFN-α治疗和未治疗的慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T细胞亚群细胞频数及各亚群上Tim-3表达的变化。采用流式细胞术检测IFN-α治疗和未治疗的慢丙肝患者外周血中CD8+T细胞及各亚群频数及膜表面Tim-3表达水平的方法;q T-PCR检测血清中HCV-RNA水平;Spearman相关性分析CD8+T细胞频数、Tim-3表达与HCV-RNA之间的相关性。结果显示,慢丙肝患者外周血CD8+T细胞频数较健康对照组、IFN-α治疗组显著降低(P0.01)。初始T细胞明显增加(P0.01)。TCM、TEM细胞分布频率降低(P0.01)。经IFN-α治疗后,CD8+T细胞百分率上升(P0.05),初始T细胞数量下降(P0.01),TCM、TEM细胞频数均升高(P0.01)。三组人群TEMRA细胞频数无统计学差异。与健康对照组、IFN-α治疗组相比,慢丙肝患者CD8+T细胞及各亚群Tim-3表达水平均有上调(P0.05)。经抗病毒治疗后,CD8+T细胞、Naive细胞、TEM细胞、TEMRA细胞亚群Tim-3表达明显降低(P0.05),TCM细胞亚群中Tim-3表达也有降低,但无统计学差异。Spearman相关性分析发现:慢丙肝患者外周血CD8+T细胞百分率与病毒载量呈反比(r=-0.3775,P0.01),而Tim-3表达水平与病毒载量正相关(r=0.6230,P0.0001)。由此可知,HCV感染慢性化时可出现CD8+T细胞亚群分布异常及各亚群Tim-3过表达。IFN-α通过调节各CD8+T细胞亚群分化状态,及下调各群细胞表面Tim-3的表达,促进HCV免疫清除。     

再生障碍性贫血和真性红细胞增多症患者TCRζ链基因表达情况

目的:析再生障碍性贫血(AA)和真性红细胞增多症(PV)患者外周血T细胞中TCR ζ链基因表达水平,从而了解患者T细胞活化过程的相关变化情况.方法:利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测25例AA患者、12例PV患者及30例正常人的外周血单个核细胞(PBMCs)的TCR ζ链基因表达情况,β2微球蛋白基因(β2M)为内参照,根据相对定量公式:2- △△Ct计算患者与正常人TCR ζ链基因表达差异倍数.结果:与正常人相比,TCR ζ链基因表达水平有40% AA(10例)和41.7% PV(5例)患者呈表达上调,其它的(60?和58.3%PV患者)则呈表达下调情况,TCR ζ链基因表达水平的变化与患者年龄无相关性.结论:AA和PV患者可能存在T细胞活化相关的信号通路紊乱的情况,TCR ζ链基因表达模式改变的意义仍需进一步研究.