CML细胞抗原相关TCR Vα13／Vβ21和Vα18／Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法:利用RT-PCR和基因扫描分析1例CML患者外周血单个核细胞中的TCR Vα和Vβ基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα和Vβ亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点,寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果:该病人外周血T细胞表达18个TCR Vα和12个TCR Vβ亚家族,其中Vα13、Vα18、Vβ1和Vβ21亚家族呈寡克隆性。CDR3序列分析获得3个TCR克隆基因序列,分别为Vα13NJα49、Vα18NJα50和Vβ21NDβNJβ2.7。结论:获得1例CML病人外周血克隆性增殖αβ T细胞的3个TCR基因CDR3序列,提示病人可能存在与CML细胞抗原相关的Vα13/Vβ21或Vα18/Vβ21T细胞克隆。     

RNA干扰下调PPP2R5C对T-ALL TCR Vβ亚家族分布和克隆增殖的影响

目的:基于前期利用靶向PPP2R5C基因的小干扰RNA(PPP2R5C-siRNA)抑制白血病T细胞增殖的结果,进一步了解PPP2R5C-siRNA对T-ALL样本中TCR Vβ亚家族基因谱系及其克隆性增殖情况.方法:利用PPP2R5C-siRNA转染2例初发未治疗T-ALL病人外周血单个核细胞(PBMC),设无关序列对照组(SC)和空白对照组(NC);利用实时定量PCR检测PPP2R5C基因表达水平.利用RT-PCR扩增各组样本中24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区3(CDR3);阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,了解其Vβ亚家族T细胞克隆性.结果:PPP2R5C-siRNA处理后明显下调PBMC中PPP2R5C基因表达水平.2例初发T-ALL外周血中分别可检测到10和17个Vβ亚家族,多数Vβ亚家族T细胞为多克隆性,病例1中Vβ9和Vβ17为寡克隆性,而病例2中,Vβ14和Vβ16呈寡克隆性;经过RNA干扰处理后,TCR Vβ亚家族表达率降低,仅检测到3和4个Vβ亚家族,分别为Vβ2,Vβ3,Vβ16和Vβ17.其中2个Vβ家族的寡克隆性模式发生改变,病例1中,Vβ17转为多克隆,而病例2中,Vβ16也转变为多克隆.结论:RNA干扰下调白血病T细胞PPP2R5C基因表达抑制细胞增殖时,在一定程度上影响TCR Vβ亚家族T细胞增殖和克隆模式变化,对正常T细胞功能可能存在一定影响.     

NB4和HL - 60细胞诱导的脐血T细胞TCR Vβ基因谱系分析

目的：了解经NB4细胞和HL-60细胞体外诱导后脐血T细胞的TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞／肿瘤细胞培养（MLTC）方法,用经丝裂霉素灭活的NB4细胞和HL-60细胞体外诱导脐血T细胞增殖,利用RT-PCR分析经MLTC前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族的利用情况,并用基因扫描分析其克隆性特点。结果：诱导前脐血T细胞表达20个TCR Vβ亚家族,诱导后的T细胞所表达的TCR Vβ亚家族随培养时间增加而逐渐减少,且诱导组呈现出克隆趋势或寡克隆增殖特点。两种细胞诱导后10d均可见Vβ1的克隆增殖出现变化,此外,NB4诱导的T细胞出现Vβ15,而HL-60诱导的T细胞则出现Vβ23的克隆增殖情况。结论：NB4细胞和HL-60细胞可诱导脐血TCR VβT细胞克隆性增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与特异性抗原介导的细胞免疫反应有关。     

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的：了解慢性粒细胞白血病（CML）相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养（MLTC）方法，利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖，用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCRVtx亚家族基因的互补决定区（CDR3），了解各Vd亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果：经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vd谱系基因（1—14个亚家族），两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势；正常人外周血出现寡克隆增殖的Va5、Vα14亚家族T细胞。结论：CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。     

淋巴瘤白血病患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性

目的:了解B细胞淋巴瘤白血病(LL)患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性.方法:利用RT-PCR分别扩增3例LL患者外周血单个核细胞的 TC R Vβ 24个亚家族基因的CDR3,以了解患者各Vβ亚家族的利用情况,然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性.结果:患者中仅存在2～6个Vβ亚家族T细胞.基因扫描分析显示,2例患者外周血中的Vβ1 、Vβ 3或Vβ4亚家族出现克隆性增殖T细胞. 结论:LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应.     

肿瘤患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞TCR Vβ基因克隆化分析

目的探讨肿瘤患者T细胞抗原受体(TCR)Vβ基因克隆化改变特征.方法应用多引物巢式PCR技术检测肿瘤患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的克隆化改变,与正常对照组比较,分析肿瘤患者TCR单克隆改变的特点.结果 CD8+T细胞TCRVβ基因亚家族单克隆改变的数量多于CD4+T细胞;肿瘤患者的CD4+T细胞中,只有Vβ2,Vβ7和Vβ8三个亚家族单克隆改变高于正常对照组(P0.01或P0.05),其他Vβ亚家族单克隆改变与正常对照组无明显差异.肿瘤患者的CD8+T细胞中,有14个Vβ亚家族单克隆改变均高于正常对照组(P0.01或P0.05);4组肿瘤患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR Vβ7亚家族的单克隆改变均明显高于正常对照组(P0.01或P0.05).结论通过检测TCR Vβ基因克隆化改变,可以初步了解T细胞对肿瘤的免疫应答状况.     

淋巴瘤白血病患者TCRVβ亚家旆T细胞的分布及其克隆性

目的：了解B细胞淋巴瘤白血病（LL）患者TCRVβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法：利用RT－PCR分别扩增3例LL患者外周血单个核细胞TCRVβ24亚家族基因的CDR3，以了解患者的Vβ亚家族的利用情况，然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的GDR3长度，了解T细胞克隆性。结果：患者中仅存在2－6个Vβ亚家族T细胞。基因扫描分析显示，2例患者外周血中的Vβ1、Vβ2或Vβ4亚家庭出现在隆性增殖T细胞。结论：LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞，这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应。     

再生障碍性贫血和真性红细胞增多症患者TCRζ链基因表达情况

目的:析再生障碍性贫血(AA)和真性红细胞增多症(PV)患者外周血T细胞中TCR ζ链基因表达水平,从而了解患者T细胞活化过程的相关变化情况.方法:利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测25例AA患者、12例PV患者及30例正常人的外周血单个核细胞(PBMCs)的TCR ζ链基因表达情况,β2微球蛋白基因(β2M)为内参照,根据相对定量公式:2- △△Ct计算患者与正常人TCR ζ链基因表达差异倍数.结果:与正常人相比,TCR ζ链基因表达水平有40% AA(10例)和41.7% PV(5例)患者呈表达上调,其它的(60?和58.3%PV患者)则呈表达下调情况,TCR ζ链基因表达水平的变化与患者年龄无相关性.结论:AA和PV患者可能存在T细胞活化相关的信号通路紊乱的情况,TCR ζ链基因表达模式改变的意义仍需进一步研究.     

慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究

目的:了解慢性苯中毒病人外周血中TCR Vα克隆性增殖T细胞特点.方法:利用RT-PCR方法扩增3例慢性苯中毒病人外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性.克隆性增殖T细胞PCR产物进行CDR3区序列分析.结果:3例慢性苯中毒病人外周血中Vα12和Vα19亚家族T细胞呈克隆性增殖,序列分析显示3例慢性苯中毒病人Vα12(1例)和Vα19(2例)CDR3区氨基酸序列分别是FCALSDRNTGGF,YICAVSHSGGGA和VYICAVNYGGS已被GenBank收录(EU285264、EU379941和EU429520).结论:在慢性苯中毒病人中发现3个新的TCR Vα亚家族重排序列,外周血T细胞出现的TCR Vα12和Vα19克隆性增殖T细胞可能是机体接触苯后所发生的特异性免疫反应.     

SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA).分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2<'-△△Ct>分析TCRζ链表达差异.结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降.结论:超抗原SEA联合PML-RAR α多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点.     

正常脐血TCR Vα亚家族的分布和克隆性表达

目的:了解正常脐血中T细胞受体(TCR)Vα亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法:利用RT-PCR分别扩增10例正常脐血单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因,了解各Vα亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞的克隆性.9例健康成人外周血和T细胞株Jurkat作为对照.结果:正常脐血T细胞平均表达17.30±5.48个Vα亚家族,占全部家族的59.65%±18.89%,以Vα3,4,5,6,8,10,12,13,15,17,21和Vα25为多见,健康成人外周血T细胞则大部分表达Vα亚家族,Vα1,6和Vα13在脐血中的表达率高于健康成人对照组,而Vα14和Vα16的表达率则低于对照组.T细胞株Jurkat则仅表达Vα1亚家族.基因扫描显示10例脐血中有2例在Vα24和Vα28 T细胞出现寡克隆性,其余均为多克隆性.结论:脐血中TCR Vα亚家族T细胞分布存在倾斜性,绝大部分TCR Vα亚家族T细胞均呈多克隆性,极个别可出现寡克隆性.     

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2~(-△Ct)×100%计算Elf-1基因表达水平.结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01).结论:建立SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况.     

淋系白血病人类疱疹病毒6型的感染情况

目的：了解淋巴系统白血病患者人类疱疹病毒－6型（HHV－6）的感染情况。方法：患者38例,包括急性淋巴细胞白血病（ALL）31例、慢性淋巴细胞白血（CLL）4例、淋巴瘤白血病（LL）3例,正常对照38例。取抗凝外周血,分离单个核细胞,提取DNA,用巢式PCR方法检测目标DNA。结果：HHV－6DNA阳性检出率在全部患者中为63％,其中在ALL患者中为68％,均明显低于正常对照的阳性检出率92％（P＜0．05）。另外,4例CLL患者有1例阳性,3例LL患者中2例阳性。结论：在淋巴系统恶性疾病中HHV－6的感染率低于正常人群,其临床意义有待进一步研究。     

CpG岛甲基化检测方法

目的：建立CpG岛甲基化测定方法,方法：收集20例急性粒细胞性白血病（AML）,18例多发性骨髓瘤（MM）,14例骨髓异常增生综合征（MDS）,15例慢性粒细胞性白血病（CML）及20 例正常对照组的外周血,分离单个核细胞,提取DNA,应用CpG岛思虑在化特异的方法（MSP－PCR）,测定P15和P16基因甲基化情况,结果：P15和P16基因甲基化在各种白血病的表率率分别为AML 80％和70％,MM72．2％和66．7％,MDS 57．1％和50％,CML0％,结论：P15及P16基因甲基化在AML,MM及MDS中有较高表达,而在CML中不表达。     

刚果红与β-环糊精及其衍生物的包合物与DNA的作用研究

用荧光光谱法、紫外-可见分光光度法在生理条件下（pH-7．41）研究了β-环糊精（β-CD）、6-去氧-（N-胺乙基）环糊精（CR—β—CDen）分别与刚果红（CR）的包合作用;研究了CR,（CR—β—CD）和（CR—p—CDen）超分子体系与小牛胸腺DNA的相互作用。紫外滴定实验结果表明：（1）β-环糊精和6-去氧-（N-胺乙基）环糊精都与客体分子刚果红发生超分子作用;（2）CR,CR—pCD,CR-β-CDen与小牛胸腺DNA作用的结合常数Kb值分别为4．1×10^4L／mol,1．36×10^5L／mol,2．33×10^5L／mol,表明超分子体系CR-β-CDen与DNA的相互作用最强。荧光实验结果表明三种化合物CR,CR—β—CD,CR-β-CDen的荧光强度随着CT—DNA的增加而增大,其中环糊精衍生物CR—β—CDen荧光增强效果是最好的。     

慢性ITP患者外周血调节性T细胞及相关细胞因子的研究

为研究慢性特发性血小板减少性紫癜（CITP）患者外周血CIM＋CD25＋调节性T细胞（Treg）数量及转化生长因子β1（TGF—β1）的表达水平,探讨它们在CITP发病机制中的作用。流式细胞仪分别检测26例CITP患者及20例健康人外周血Treg细胞的数量,ELISA法检测血清中TGF—β1的含量,并进行相关性分析。CITP患者外周血Treg细胞的数量明显低于正常对照组（P〈0．05）;CITP患者血清TGF—β1的含量也低于正常对照组（P〈0．05）,差异有统计学意义,CITP患者外周血Treg细胞的比例与血清中TGF—β1的含量都呈正相关（P〈0．05）。CITP患者外周血中Treg细胞数量的减少及TGF－β1含量的降低可能与CITP的细胞免疫失调有关。     

急性早幼粒细胞白血病病人外周血TCR Vβ亚家 …

近年国外报道利用Ｔ细胞受体（ＴｈＲ）β基因的可变区（Ｖβ）２４个亚家族的特点,分析肿瘤或自身免疫性疾病病人中各 ＴＣＲ Ｖβ亚家族Ｔ细胞的表达情况,从而更为深入地了解病人的细胞免疫功能状态,并为临床上进一步开展特异性免疫治疗提供新的资料［１,２］。本研究利用ＲＴ－ＰＣＲ方法分析６例急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）病人Ｖβ亚家族Ｔ细胞的表达情况。１材料与方法 （１）材料：经细胞形态学和细胞化学检查等角诊的初发ＡＰＬ病人６例。收集治疗前病人外周血并分离单个核细胞（用淋巴细胞分离液按常规方法进行）。 （２）…     

SLE患者外周血γδT细胞系的建立及表型和功能的研究

目的:建立体外扩增系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血γδT细胞的方法,并初步分析其表型和功能,探索γδT细胞在SLE发病中的作用。方法:采用单克隆抗体固相法,对15例SLE患者和8例正常人外周血γδT细胞进行体外扩增建系,以流式细胞仪检测γδT细胞表型,并用MTT法观察γδT细胞对Daud i细胞的细胞毒作用。结果:建立了SLE患者外周血γδT细胞系,其平均纯度为(58.1±11.2)%,较正常对照组(80.3±9.2)%偏低(P<0.05);其细胞表型为:Vδ1(34.4±24.5)%、Vδ2(61.9±28.6)%、Vδ3(16.1±10.6)%、Vγ9(76.4±11.8)%,其中Vδ2表达较对照组降低,而Vδ1和Vδ3表达增加(P均<0.05);其细胞毒作用在二组间无明显差别。结论:SLE患者外周血γδT细胞的Vδ、Vγ基因的取用表达存在差异,提示其在SLE的发病中可能起一定作用。     

β-环糊精对化合物RSA的增溶研究

化合物17α-羟基孕甾4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯（RSA）和β-环糊精（β-CD）经超声波处理15min，在28℃，120r／min振荡处理12h，形成包结物。β—CD—RSA包结物的紫外吸收特征与化合物RSA一致。在水溶液中，β—CD与化合物RSA的包结物，化学平衡常数K1的RSD为2．84％，较为稳定，推测在水溶液中β—CD与化合物RSA以1：1（摩尔比）形成包结物。红外光谱分析推测出在水溶液中β—CD与化合物RSA的包结方式。β-CD与化合物RSA摩尔比为1：1形成的β—CD—RSA包结物，在28℃水溶液中的溶解度为9．12mg／L，比化合物RSA饱和溶液的溶解度增大了5．26倍。     

N-(4-甲基苄基)-3,5-双(4-氯苄叉基)-4-哌啶酮的合成、单晶结构分析以及生物活性的测定

以取代苄胺为原料,经过Michael加成、Dieckmann缩合、水解脱羧、羟醛缩合等反应,合成一个未见文献报道的化合物：N-（4-甲基苄基）-3,5-双（4一氯苄叉基）-4-哌啶酮．目标化合物的结构经元素分析、核磁共振氢谱（^1HNMR）、红外光谱（IR）、质谱（EI-MS）及单晶X-射线衍射测定确定．该单晶属于单斜晶系,空间群为P2（1）,α=17．1226（16）,b=6．28396（6）,c=21．468（2）,α／=90°,β=99．753°,y=90°,V=2276．5（4）^3,Z=4,Dc=1．308g／cm^3=0．304mm^-1,M,=448．36,F（000）=936,S=1．019,R=0．0585以及wR=0．1456．目标化合物的结构是非平面的,哌啶环呈沙发构象．化合物中的碳碳双键都是E式构的．在晶体结构中没有分子内和分子间氢键存在．生物活性测试结果表明：目标化合物对白血病K562细胞系的增殖有明显的抑制作用,具有潜在的抗癌活性．