南方红豆杉细胞培养中紫杉醇代谢调节的研究

对南方红豆杉悬浮培养细胞的生长动力学和紫杉烷类物质积累的动力学进行了探讨．紫杉醇合成途径中由巴卡亭Ⅲ生成紫杉醇的反应是受阻的．加入pH稳定剂MES可以减少巴卡亭Ⅲ向胞外的分泌，提高了紫杉醇总量和在细胞内的积累．     

诱导促进中国红豆杉细胞培养中紫杉烷的积累

通过甲苯莉酮酸酯（MJA）或二氢甲基苯莉酮酸酯（HMJA）的诱导，有效增强了中国红豆杉（Taxus chinensis）悬浮细胞培养中新型生理活性物质云南紫杉烷（taxuyunnanine C,Tc）的积累。在培养第7天添加500μmol/L MJA后，产物的胞内最大含量为每克干细胞含29.5ng Tc，但细胞生长受到明显抑制；在添加100μmol/LMJA时，Tc的总产量达最大，为300mg/L。紫杉烷生物合成途径中的关键酶紫杉二烯合成酶的活力在被诱导后也获得大幅度提高。     

影响红豆杉生长的主要生态因子

红豆杉的生长受多种因子的影响,研究这些影响因子的作用对日益兴起的产业化栽培经济效益的实现、森林恢复和野生资源的保护意义重大。从红豆杉的品种、气候因子、海拔、地形和土壤、动物采食及人为因素等方面,综述了影响红豆杉生长的生态因子。温度、光照强度和降水是影响红豆杉生长和分布的3个主要气候因子,其中温度是影响种子萌发的关键因素。红豆杉在缓坡上比在陡坡上生长得好,喜欢酸性、肥沃的土壤。动物的采食对幼苗的生长影响很大,保育植物可以促进红豆杉种群的更新。红豆杉属植物普遍生长缓慢,南方红豆杉是生长最快的品种,经过优良种质的选育,可能成为生产紫杉烷类化合物的一个主要栽培种。还提出了今后几个相关的研究方向。     

南方红豆杉悬浮培养细胞中糖代谢的波动性及其与紫杉烷合成关系的研究

针对悬浮培养南方红豆杉细胞利用不同浓度的蔗糖进行了研究,通过检测细胞内外的蔗糖,果糖和葡萄糖以及胞内淀粉含量的变化,发现细胞团体系中碳素代谢是以胞内淀粉变化为核心的,蔗糖,葡萄和果糖的消耗和吸收呈现波动性,从而促进使细胞生物量的增国和紫杉烷类化合物的合成,同时研究发现细胞对蔗糖的消耗有一个临界点,即培养液中有1mg/mL的蔗糖不能被吸收,而培养液中浓度为3％的蔗糖对细胞攻产物合成最为有利,蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖,其中葡萄糖有利于细胞的前期生长以获得大量的生物量,果糖在中期添加有利于细胞培养后期合成紫杉烷类化合物,其中紫杉醇并不是次生代谢途径的最终产物。     

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

 从南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A (29.0%),351 C (20.7%),362 G (21.4%)和489 T (28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值) 模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支－位点模型的分析表明：紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。     

中国红豆杉悬浮细胞高密度培养

采用３０ｇ／Ｌ起始糖浓度,通过在细胞对数生长后期补料的方法成功地在２５０ｍＬ摇瓶和１．５Ｌ搅拌式生物反应器中进行了细胞高密度培养,经２０ｄ培养,细胞干重超过２５ｇ／Ｌ。在反应器培养中,次生代谢产物紫杉烷的产量较低。通过高密度培养,明显增加了细胞量,还可以提高反应器中紫杉烷的产量。     

红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展

综述了近年来红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展, 包括红豆杉细胞培养生产紫杉醇的代谢调节、无机盐、植物生长调节因子、糖分及其它因素对红豆杉细胞生长和紫杉醇生产的影响等.着重介绍了前体饲喂、添加抑制剂和添加诱导子对红豆杉细胞生长及紫杉醇生产的影响.     

模拟移动床分离紫杉醇

以东北红豆杉树叶为原料,采用无毒、无污染的乙醇作为提取溶剂.在高分子树脂柱和模拟移动床色谱(SMBC)系统上逐级提纯紫杉醇,除去大量非紫杉烷与紫杉烷类杂质,得到了高纯度的产品.同时,对紫杉醇前处理过程中洗脱液条件,随后的SMBC系统实验中的切换时间等条件进行了优化,并总结出一套优化操作条件,为纯化紫杉醇提供了合理的工艺路线.     

脉冲电场对中国红豆杉细胞的影响

通过二维电泳（2-DE）技术来研究脉冲电场作用后48 h中国红豆杉细胞在蛋白表达上的变化.共进行了3次二维电泳重复实验，经过相关因子分析证实具有较高的重复性.比较对照组和经过脉冲电场处理的实验组的二维电泳图谱，发现有较明显的差异.用基质辅助激光解析-飞行时间质谱和液相色谱-电喷雾质谱对其中的部分蛋白进行分析鉴定.鉴定结果表明：核糖核酸蛋白粒、醛糖差向异构酶和铁氧还蛋白-NADP(+)还原酶这三个蛋白可能是与脉冲电场诱导相关的蛋白.     

陡脉冲诱导在体瘤细胞凋亡的实验及分析

检测陡脉冲电场作用下Wistar大鼠在体瘤细胞的Bcl-2和Bax基因编码蛋白表达,探讨陡脉冲诱导在体瘤细胞凋亡的机理.用免疫组织化学法和原位缺口末端标记(TUNEL)法分别检测18例荷有Walker-256瘤株的Wistar大鼠瘤细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达阳性率和凋亡细胞百分率.结果表明:1)陡脉冲电场对在体瘤细胞有显著的治疗作用,治疗组可见大量肿瘤坏死组织,对照组瘤细胞呈弥漫性密集分布,浸润性生长;2)TUNEL检测结果:治疗组的细胞凋亡率明显高于对照组;3)Bcl-2、Bax蛋白表达:陡脉冲电场作用后,Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达增强.陡脉冲电场能诱导瘤细胞凋亡,其分子机制是下调Bcl-2蛋白表达,增强Bax蛋白表达.     

红豆杉细胞在反应器中培养动力学的研究

应用气升式生物反应器及搅拌式生物反应器悬浮培养红豆杉细胞,得到细胞生长和紫杉醇合成动力学曲线.经过反应器动力学的比较,结果表明红豆杉细胞较适于在机械搅拌式反应器中培养.     

中国红豆杉悬浮细胞固定化培养生产紫杉醇

对海藻酸钠包埋法固定中国红豆杉悬浮细胞的条件进行研究,建立了一套合适的固定化操作条件,即海藻酸钠浓度为３０ｇ／Ｌ,聚乙烯醇（ＰＶＡ）浓度为８０ｇ／Ｌ,ＣａＣｌ２浓度为２０ｇ／Ｌ,包埋密度为０．２ｋｇ／Ｌ,接种密度为０．１ｋｇ／Ｌ．在此基础上,对中国红豆杉细胞固定化培养的培养基进行了优化,结果表明,从红豆杉树皮中分离出的真菌培养物作为诱导物能限制细胞生长,且明显促进紫杉醇合成,并诱导紫杉醇分泌到培养液中．在培养基中适量地添加前体亦能提高紫杉醇的产量．对红豆杉细胞固定化培养中紫杉醇合成与分泌进行了动力学研究．     

红豆杉愈伤组织诱导及细胞培养的研究

本文研究了从红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｓｅ）的嫩茎诱导愈伤组织的过程．探讨了红豆杉细胞悬浮培养和平板培养的方法．结果表明：在所实验的３种培养基（ＭＳ，Ｂ５，Ｗｈｉｔｅ）中，虽然都能诱导红豆杉幼茎产生愈伤组织，但以ＭＳ培养基较好，其中ＭＳ＋２．４－Ｄ１ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／ｌ培养基愈伤组织诱导率高达９８％．ＭＳ和Ｂ５液体培养基均可作为红豆杉单细胞悬浮培养的培养基，普通平板培养法培养红豆杉单细胞的植板率只有０．０３％，有待改进其它平板培养法     

电导率法监测红豆杉细胞的生长

对红豆杉细胞在 2 5 0mL和 2L摇瓶及 1 0L反应器中的生长情况进行了研究 .应用电导率法监测红豆杉细胞的生长 ,得出在红豆杉细胞悬浮培养的细胞生物量与培养液电导率变化的相关性 .     

Involvement of NO in fungal elicitor-induced activation of PAL and stimulation of taxol synthesis in<Emphasis Type="Italic">Taxus chinensis</Emphasis> suspension cells

Elicitor prepared from the cell walls of Peni-cillium citrinum induces multiple responses of Taxuschinensis cells, including nitric oxide (NO) generation, se-quentially followed by the activation of PAL and synthesis oftaxol. NO scavenger cPITO and nitric oxide synthase (NOS)inhibitor PBITU prevent the latter two reactions, all of whichare triggered in the absence of elicitor by NO donor sodiumnitroprusside (SNP). The elicitor-induced NO release ofTaxus chinensis suspension cells is strongly inhibited byPBITU. These results demonstrate a causal relationship be-tween NO generation and the latter two reactions of Taxus chinensis cells to the elicitor, and also indicate that NO, pro-duced via NOS in Taxus chinensis cells treated with fungalelicitor, might act as an essential signaling molecule for trig-gering the activation of PAL and synthesis of taxol.     

红豆杉细胞培养中抗褐变剂的筛选

研究了８种药剂对红豆杉愈伤组织的抗褐变影响,结果证实：活性炭（１０００ｇ／Ｌ）、水解乳蛋白（６００ｍｇ／Ｌ）、植酸（１００ｍｇ／Ｌ）等３种药剂的抗褐变效果最好,且对多酚氧化酶的抑制效果也最好．     

双载体固定化中国红豆杉细胞的初步研究

对采用海藻酸钠和聚乙烯醇（ＰＶＡ）混合的双勒体包埋中国红豆杉悬浮细胞的条件进行了初步研究,建立了一套合适的国家化细胞条件,海藻酸钠浓度为３０ｇ／Ｌ,聚乙烯醇（ＰＶＡ）浓度为７０ｇ／Ｌ,ＣａＣｌ２浓度２０／Ｌ,包埋浓度为０．１８ｇ／Ｌ,接种密度为０．１２ｇ／Ｌ,在此基础上,对中国红豆杉细胞固定化２的培养基进行了优化,实验结果表明,从红豆杉树皮中分离出的真菌物作为诱导物能限制细胞生长,且明显促进紫杉醇     

连续灌注培养红豆杉细胞生产紫杉醇的研究

利用由一圆形柱和三角瓶组成的生物反应器对红豆杉细胞进行连续灌注培养，结果显示，培养基的pH值，糖和磷的变化幅度较平缓，细胞的生长期长，说明该反应器适于细胞生长，根据该反应器具有培养液提取简便的特点，首次提出诱导子可按照培养基中残糖和残磷的体积质量加入，而且发现高含量紫杉醇仅发生在特定的残糖和残磷体积质量下，结果还显示该反应器用于诱导和萃取结合处理细胞，与搅拌式和气升式反应器相比，得到较高的生物量和紫杉醇产量，这些结果表明该反应器可用于连续灌注培养红豆杉细胞生长紫杉醇。