携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的研究中得到有效应用     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

LITAF基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法：设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段,应用EcoRI、BamHI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒。将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western-blot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。结果：LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。结论：成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

两种抑癌基因逆转录病毒载体的重组及包装

将两种分别含抑癌基因ｐ３５,Ｒｂ的逆转录病毒载体（ｐＢａｂｅ－ｎｅｏ）重组,并利用病毒包装细胞ＰＡ３１７对其进行包装,测得两种逆转录病毒ｐ３５－ｐＢａｂｅ－ｎｅｏ,Ｒｂ－ｂＢａｂｅ－ｎｅｏ的滴度分别为４．８×１０５ｃｆｕ／ｍＬ和１．３×１０５ｃｆｕ／ｍＬ,并证实这两种重组逆转录病毒具高效感染性．     

核糖体蛋白RPL34-PS1对B细胞淋巴瘤的生长促进作用

一种核糖体蛋白RPL34具有促进B细胞淋巴瘤生长的作用,通过分子克隆将RPL34基因的序列克隆到逆转录病毒载体pBABE-Puro上后,包装逆转录病毒并感染Balb/c小鼠来源的B淋巴瘤细胞38B9,经嘌呤霉素筛选后构建稳定过表达RPL34的B淋巴瘤细胞系RPL34-38B9。体外培养计数比较细胞增殖变化情况;流式检测细胞凋亡和细胞周期水平;小鼠皮下荷瘤并测量肿瘤体积。结果表明:过表达的核糖体蛋白RPL34能够显著促进B淋巴瘤细胞的生长速率,减少细胞凋亡,同时能够显著增加B淋巴瘤细胞的成瘤速率。     

脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法,并检测其体外表达目的基因的水平。设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段;应用EcoRI、Bam HI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒,将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Westernblot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。说明成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

反显性突变Tat蛋白抑制人免疫缺陷病毒1型的复制

Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）蛋白是人免疫缺陷病毒ＨＩＶ基因组编码的返式式激活因子。为了进一步研究Ｍ５Ｔａｔ和Ｍ６Ｔａｔ蛋白对ＨＩＶ病毒复制的抑制作用，将可被Ｔａｔ调控的启动子ＹＬ１５８替换基因治疗中常用的逆转录病毒载体ＬＮＣＸ中的ＣＭＶ启动子，构建了表达上述反显性Ｔａｔ蛋白的逆转录病毒载体，随后导入双向性包装细胞ＰＡ３１７细胞中，用产生出的复制缺陷病毒感染ＭＴ４Ｔ淋巴细胞。用ＨＩＶ－１病     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

工业包装线上开口容器内液体的晃动控制

研究了工业包装线上开口容器内液体的晃动控制,建立了矩形容器、圆柱形容器和一般直立旋转对称容器线性充液控制系统的状态方程．采用能量最优控制方案,得到了线性控制律,计算得到了运动时间步长与液面波高响应的关系曲线,并对矩形容器的晃动控制进行了数值仿真实验．比较了理论结果与仿真结果的差别,以及对液体晃动残余能量影响的分析,给出了线性模型的适用范围．     

药品包装线控制系统设计与实现

传统的药品包装线控制系统中存在的包装效率低以及药品检测难等方面的问题,提出采用了把整条包装线分为4个输送阶段的工艺设计,应用变频调速,以及运用光电传感器检测药品定位情况,运用微动开关作为药品到位检测手段.该设计有效地提高了包装速度,解决了传统包装线药品定位不准,以及检测药品到位成本过高这这些方面的缺点.应用结果表明,本控制系统具有控制精度高、运行稳定可靠、投资成本低等特点,充分满足药品包装生产线的控制要求.     

OA对人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402增殖的影响和对细胞凋亡的诱导作用研究

 以人肝细胞HL-7702和肝癌细胞Bel-7402为研究对象,通过MTT法、细胞外部形态观察、Annexin V.FITC&;PI双染法及TUNEL法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）对其增殖的影响及对细胞凋亡的诱导作用。结果表明：OA对人两株细胞的增殖均有显著的抑制作用,24 h IC₅₀分别为65 ng/mL和60 ng/mL,且这种抑制作用呈剂量依赖性。OA导致两株细胞的形态均发生明显变化：细胞变圆,脱壁,细胞膜形成泡状突起,最终形成膜包裹的凋亡小体。Annexin V.FITC和PI双染法及TUNEL法检测均发现：OA能够诱导两株细胞发生不同程度的凋亡,且凋亡细胞的比例与OA的浓度相关。以上结果表明：OA能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而对人肝细胞和肝癌细胞造成影响,且这种影响的程度与OA的浓度和作用时间密切相关。     

水泥生产线定量包装的电气控制系统设计

在分析水泥生产线特点的基础上,介绍了基于AVR单片机的水泥生产线定量包装的电气控制系统硬件系统与软件系统设计,实现了对水泥生产线定量包装的自动化,从而改善工业生产条件,该设计方案具有良好的应用价值.     

MTT法检测大豆异黄酮对癌细胞的生长抑制作用

本文选择小鼠红白血病细胞系CML-K562和大鼠肝癌细胞系CBRH-7919作为大豆异黄酮的作用对象,通过MTT法检测大豆异黄酮对CML-K562和CBRH-7919的抑制作用.结果显示,大豆异黄酮对小鼠红白血病细胞系CML-K562和大鼠肝癌CBRH-7919细胞生长均有抑制作用,其抑制率达到50%时,所需要的用量即IC50分别为15.36 mg/L和16.58 mg/L.     

小鼠胸腺瘤细胞程式死亡调控的初步研究

通过对小鼠胸腺瘤细胞的筛选,获得了具T_(cR)V_~+CD4~+CD_~+表型的CD11.3-D_2细胞株,钙离子载体lonomycin能够诱导其死亡,而抗CD_3单克降抗体却不能介导它死亡,CD11.3-D_23细胞可作为研究细胞程式死亡(Programmed Cell Death)机理和胸腺细胞发育分化机理的体外模型.     

基于Petri网的高速机器人果奶包装生产线设计方法

针对国内饮料行业产品包装生产线升级换代的问题,提出了一种以高速搬运机器人为核心的新型果奶包装生产线设计方法.首先,基于果奶包装生产线的工艺分析,提出用机器人代替人工的新型生产线布局形式;其次,利用Petri网技术建立了该生产线模型,并基于不变量的方法分析了生产线系统的可达性、安全性、无死锁性;最后,在实验测得各个工作站作业时间的基础上,利用EM-Plant软件对生产线进行了仿真.分析和仿真结果表明,采用机器人的新型果奶包装生产线方案可行且有效.     

奥曲肽对鼻咽癌细胞株CNE2生长和细胞周期的影响

观察了一定剂量的奥曲肽对鼻咽癌细胞株CNE2的细胞生长与细胞周期的影响,探讨药物对的抗肿瘤作用,从而为临床治疗鼻咽癌提供一种新的思路,并在理论上奠定一定基础。用MTT法检测细胞生长抑制作用,流式细胞仪（FCM）检测细胞周期,t检验进行统计学分析。结果表明：1．0nmoL／L-1．0μmol／L的奥曲肽均能抑制鼻咽癌细胞株CNE2的生长,且在此范围内明显呈药物量——效关系,1．0μmol／L的奥曲肽可以使鼻咽癌细胞株CNE2阻滞在G0／G1期。一定剂量的奥曲肽能够抑制鼻咽癌细胞株CNE2的生长,奥曲肽有望在药物治疗鼻咽癌方面发挥一定的作用,值得进一步研究。     

经砷诱导人肝细胞L02获得砷耐受性的研究

砷是自然界普遍存在的毒性较强的类金属元素。几乎所有生物在进化中都产生了对砷毒性的耐受性。生物体对砷的耐受机制受到广泛关注。本实验采用低剂量(4μmol／L)NaAsO2诱导人体正常肝细胞株LO2,利用噻唑兰检测法(MTT)计算细胞生存率及半数致死量反映细胞对砷耐受性的改变，结果发现低剂量砷诱导6周后，在48h急性砷中毒试验中，实验组LC50为23．0μmol／L，对照组为11．9μmo1／L，实验组明显高于对照组，说明细胞对急性砷中毒耐受性明显提高。     

食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

为分离及鉴定食管癌Eca109肿瘤干细胞。将购买上海生命科学研究院的食管癌Eca109细胞株采用有限稀释法进行单克隆培养并进行HE染色;应用免疫细胞化学技术检测Eca109单克隆细胞株中P75NTR、Oct-4的表达;MTT法和平板克隆实验检测细胞体外增殖情况。Transwell小室法检测各细胞株侵袭能力。结果显示,HE染色示细胞形态有圆形、核大和短梭形、核小两种;在Eca109单克隆的细胞中P75NTR强表达、Oct-4表达相对较弱,且在圆细胞株中表达定位于胞核;MTT法测增殖示圆细胞株增殖率明显高于其他细胞株,差异有统计学意义(P<0.001);平板克隆实验示圆细胞株形成克隆团数高于其他细胞株且细胞团大;Transwell法结果示各细胞株侵袭能力相当。由此可知,Eca109细胞中P75NTR、Oct-4核表达阳性的圆细胞有可能为食管癌干细胞。