优化的热启动PCR—限制性酶切法检测冠心病患者？…

改进传统的载脂蛋白Ｅ基因多态性检测方法，建立热启动聚合酶链反应－限制性片段长度多态性检测分析方法。方法：应用热启动ＰＣＲ－限制性内切酶酶切－聚丙烯酰胺凝胶电泳－固定银染法测定１５８例冠心病患者和１１６例正常对照者的ＡｐｏＥ基因型。     

二甲亚砜在聚合酶链反应扩增载脂蛋白E基因中的作用

目的：探讨二甲亚砜（DMSO）在聚合酶链反应（PCR）中扩增人类载脂蛋白E基因中的作用。方法：在不同质量分数DMSO的存在下,以PCR技术增人类载脂蛋白E基因片段。限制性内切酶酶切检测扩增产物。结果：在质量在分数5%-10%的DMSO下,可以成功地扩增到人类载脂蛋白E基因的第4外显子片段。结论：在DMSO作用下,PCR扩增增强了特异性。扩增的人类载脂蛋白E基因片段可以进行基因限制性片段多态性的分析。     

DNA分子标记的发展及主要技术

DNA分子标记技术是一种新的比较理想的遗传标记,本文综述了DNA分子标记技术的发展概况、种类及特点,以及广泛应用于农作物分子标记基因定位的分子标记技术：限制性片段长度多态性（RFLP）,随机扩增多态性DNA（RAPD）,简单序列长度多态性标记（SSR）和扩增的限制性内切酶片段长度多态性（AFLP）的原理、特点及他们的优缺点。     

中国人群MTHFR基因A677V多态性

目的：研究在广东汉族人群中四氢叶酸还原酶基因６７７位点是否存在多态性。方法：运用多聚酶链反应－限制性内切酶片段长度多态性技术（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）检测ＭＴＨＦＲ的６７７位点多态性。结果：在中国广东汉族人群中,Ｃ等位基因的频率为０．７。结论：ＭＴＨＦＲ的６７７位碱基存在着多态性,为进一步研究该位点多态性与妊高征的相关性奠定了基础。     

绒螯蟹线粒体细胞色素b基因的RFLP分析

对中国大陆4个水系的8个地理种群绒螯蟹样本的线粒体细胞色素b基因片段进行了PCR扩增，并应用6种限制性内切酶对该PCR产物进行RFLP分析．在应用的6种内切酶中，HinfⅠ，RsaⅠ和EcoRⅤ酶切该PCR片段后，在某些地区绒螯蟹之间表现出限制性片段长度多态性，为多态性的内切酶，但在本研究中尚未发现种群特异的RFLP标记．应用3种多态性的限制性内切酶对8个地理种群的绒鳌蟹个体样本的线粒体细胞色素b基因片段进行RFLP分析，共检测到5种复合限制性酶切类型，即AAA型、BBB型、ABA型、BAB型、ACA型．依据群体间的净遗传距离绘制的UPGMA分子系统树显示，合浦绒螯蟹形成了独立的一支．     

鲇16SrRNA基因扩增片段的RFLP研究

利用PCR技术进行了鲇(Silurus asotus)5个地理种群线粒体DNA(mtDNA)限制性片段长度多态性(RFLP)研究.这5个地理种群是长江上游支流(四川境内的攀枝花雅砻江、岷江、自贡、贵州遵义的乌江)和长江中游支流沅江上游的潕阳河.选用10种限制性内切酶水解,只有HaeIII产生了限制性片段长度多态性.在长江上游支流的各地理种群之间不存在限制性片段长度多态性,长江中游支流沅江上游的潕阳河地理种群与长江上游支流的各地理种群间在该基因片段上存在一定程度的多态性变异.     

脑血管疾病患者IL—6基因调控区－174G／C多态性研究

目的：观察73例脑血管疾病患者的IL—6基因调控区—174位点的多态性与疾病的相关关系。方法：PCR扩增、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析和DNA序列测定，认识IL—6基因调控区—174位点的多态性；同时ELISA定量分析73例脑血管病患者和16例正常人血清白细胞介素—6含量。结果：73例脑血管疾病患者比—6基因调控区—174位均为GG型；血清白细胞介素—6水平升高，与正常人血清对比，差异显著。结论：73例脑血管疾病患者末发现IL—6基因调控区—174位点的基因变异。     

脑血管疾病患者IL-6基因调控区-174G/C多态性研究

目的:观察73例脑血管疾病患者的IL-6基因调控区-174位点的多态性与疾病的相关关系.方法:PCR扩增、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析和DNA序列测定,认识IL-6基因调控区-174位点的多态性;同时ELISA定量分析73例脑血管病患者和16例正常人血清白细胞介素-6含量.结果:73例脑血管疾病患者IL-6基因调控区-174位均为GG型;血清白细胞介素-6水平升高,与正常人血清对比,差异显著.结论:73例脑血管疾病患者未发现TL-6基因调控区-174位点的基因变异.     

50例中国人IX因子基因的限制性片段长度多态性

用IX因子基因内探针F9(VⅢ)对TaqI,BamHI和EcoRI酶切的50例中国人基因组DNA进行杂交分析。结果表明,所有个体经TaqI酶切的杂交片段为4.5kb和1.8kb,BamHI和EcoRI酶切的杂交片段分别为23kb和5.0 kb。基因组DNA样本中未发现限制性片段长度多态性(RFLP),这与欧美国家的民族群体中存在着IX因子基因内TaqI和BamHI的RFLP的结论不同。造成不同种族间DNA水平差异的原因,很可能与长期在不同地理环境中的进化适应有关。     

新疆哈萨克族β2肾上腺素能受体基因C659G变异与血清甘油三酯水平之间的关系

目的：研究人类β2肾上腺素能受体（ADRβ2）基因C659G变异与新疆哈萨克族甘油三酯水平间的关系．方法：采用多聚酶链式反应法及限制性内切酶片段长度多态性技术（PCR—RFLP）,对435例新疆哈萨克族人进行ADR＆基因C659G多态性检测,观察基因型和等位基因的分布频率及其与血清甘油三酯水平的关系．结果：435例哈萨克族人ADRβ2基因C659G基因型频率分别为CC85．747％、CG13．793％、GG0．64％,等位基因频率分别为C7．356％、G92．644％,分布符合Hardy—Weinberg定律．按照年龄分组后通过协方差分析扣除体重指数、平均动脉压对血清TG的影响后,可以看到各年龄分组中CG＋GG组与CC组血清TG水平均无统计学意义．结论：新疆哈萨克族人β2AR基因C659G多态性与血清甘油三酯水平无关．     

载脂蛋白E定量测定的实验评价及临床应用

目的 :评价定量测定载脂蛋白E免疫比浊法 (液体双试剂 )的实验性能 ,讨论载脂蛋白E在心脑血管疾病及老年性痴呆症发病中的作用。方法 :对测定血清载脂蛋白E免疫比浊法的线性、精密度、回收、对比、重复性试验进行测定。正常对照组 12 0例 ,分 4组 ,每 15周岁为一组 ,每组进行载脂蛋白E的测定 ;心肌梗死、脑梗塞各 2 4例 ,高血压 67例 ,老年性痴呆症 2 0例和正常对照组 12 0例 ,分别检测血清脂蛋白 (a) (Lp(a) )、总胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL c)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL c)、载脂蛋白A1(apoA1)、载脂蛋白B(apoB)、载脂蛋白E(apoE) ,对检测结果做统计学分析。结果 :免疫比浊法线性范围为 0～ 10mg/dL ,Y =0 .93 87X + 0 .3 4,r =0 .9972 ;三种不同浓度的血清精密度试验批内CV值分别是2 .85 %、2 .0 6%、2 .47% ;批间CV值分别为 4.0 1%、3 .89%、3 .67% ;内加入法平均回收率为 10 0 .14% ,两种试剂对比试验 ,Y =0 .93 4X - 0 .0 75 ,r=0 .988;重复性试验其批内批间CV值分别为 3 .12 %、3 .98%。正常对照组 4组间进行比较 ,P >0 .0 5 ,各组分别与文献报道结果比较 ,P >0 .0 5 ,无显著性差异 ;心梗与脑梗血清中apoE、Lp(a)、TG、apoB均升高 ,与正常对照组间差异显著 ,P <0 .0 5     

用cDNA-AFLP银染技术研究与花椰菜花色相关的基因

将smart cDNA PCR和AFLP银染技术结合，建立了一种新的mRNA差别显示技术，用这种方法对花椰菜黄花和白花的两个近等基因系进行了研究，找到一条差异带，经过Northern点杂交检测，发现此带为白花株系特有的谱带。     

Chromosome microdissection by laser microbeam, chromosomal fragment isolation and amplificationin vitro in barley (Hordeum vulgare L.)

A method for microdissection, isolation and amplification of plant chromosomal fragments using laser microbeam and a glass microneedle was established. Firstly, 7H chromosome of barley (Hordeum vulgare L.) was dissected by Nd: YAG laserbeam with suitable parameters and the fragment comprising a satellite was isolated with a glass microneedle which was fixed on a micromanipulator. Then, the chromosomal fragment DNA was amplified by LA_PCR (linker adaptor PCR) for two rounds. The size of the DNA fragments of PCR products varied from 500-3 000 bp and the PCR products originated from the genome of barley were verified by Southern hybridization. Compared with previous reports, there are some advantages in this research. The performance is easier, the dissection is more precise and the cost is low. It also permits efficient amplification with only one single chromosome fragment. Laser microbeam_glass microneedle method may be useful in the microdissection of special chromosome regions, especially in plants with middle or small chromosomes.     

大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法

目的:建立纯度和活力较高的无血清原代培养海马神经元的方法。方法:新生SD大鼠海马,用neuro-basal培养基培养,免疫荧光鉴定神经元纯度,MTT法检测其活力。结果:神经元接种12~24 h后贴壁,并长出细小突起,3 d具有典型神经元形态特征,4 d突起形成稀疏的神经纤维网络,8 d后神经元5~10个聚集成团,突起密集,生长稳定,12 d后出现细胞碎片。Tubulin荧光染色显示清晰的神经元,突起绵长且相互交织,占细胞总数的66.7%;GFAP荧光染色的细胞数量少,突起短粗,占33.7%。培养1~5 d MTT代谢率逐渐上升,6~11 d处于平台期,11 d后下降。结论:neurobasal无血清培养获得的神经元纯度大于60%,6~11 d的细胞适于细胞学实验。     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术，克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明，克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现，在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box，分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA；在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box，序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成，提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

载脂蛋白E-基因敲除鼠VLDL和IDL在动脉硬化中的作用

探讨载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）－基因敲除鼠极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）和中间密度脂蛋白（ＩＤＬ）组分（ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ）致动脉硬化作用．采用超离法从ａｐｏＥ－基因敲除鼠血浆中分离ＶＬＤＬ和ＩＤＬ组分,与鼠腹腔巨噬细胞共育,观察ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ与巨噬细胞的相互作用．ＡｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ导致细胞胆固醇酯含量显著增加．其诱导的细胞［３Ｈ］胆固醇油酸脂量高达１５．１ｎｍｏｌ／ｍｇ细胞蛋白,是天然低密度脂蛋白的８．４倍．形态学观察显示,经ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ处理的巨噬细胞与苏丹黑Ｂ呈阳性染色．细胞结合实验表明,１２５Ｉ－ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ与巨噬细胞的总结合可被非标记配基取代８０％以上,特异结合呈一饱和图形．同时细胞缔合和细胞内降解实验也显示相似结果．非修饰的ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ可通过一特异而不依赖于ａｐｏＥ的途径导致巨噬细胞胆固醇酯的显著蓄积     

以病毒的230 kb DNA分子为模板的DNA序列测定

目的：为确认Tn3-gpt已插入小鼠巨细胞病毒(mouse cytomegalovirus，MCMV)基因组的特定位置，改进大分子病毒DNA的测序方法，建立以230kb DNA为模板直接进行DNA序列测定的方法。方法：待测MCMV的Tr3-gpt插入突变株感染NIH3T3细胞后，从培养液中制备病毒颗粒并从中纯化得到基因组DNA，以此DNA为模板，合成的寡核苷酸为引物，用热循环方法按Promega公司的DNA Cycle Sequencing System试剂盒的方法进行测序。结果：获得纯度较高可直接作为模板进行测序的：DNA，测序所得放射自显影图片条带清晰明亮，间隔正常，分辨率较高，可顺利读出插入位点的MCMV的DNA序列，证实Tn3-gpt插入在特定的位置。结论：长达230kb的大分子病毒DNA可直接作为模板，用热循环测序方法进行测序，无需切割成小片段后才进行测序。     

北京地区部分汉族男性维生素D受体基因Tru9 I多态性与骨密度的关系

探讨维生素D受体(VDR)Tru9 I基因多态性与北京地区部分汉族男性骨密度(BMD)的关系.筛选长期居住北京地区无血缘关系的健康20～80岁汉族男性230人,应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法检测研究对象维生素D受体基因的Tru9 I基因型,使用双能X线吸收测定法检测随机抽取的106例受试者腰椎和髋部的BMD.研究对象中VDR基因Tru9 I的3种基因型TT、Tt、tt的频率分别为66.9%、30.5%、2.6%,符合Hardy-Weinberg定律;在各年龄组不同部位Tt与tt基因型BMD值之和大多偏高于TT基因型,但差异无统计学意义(P>0.05).但在20岁组的L2-4部位Tt与tt基因型BMD值之和明显高于TT型(P=0.058).校正年龄、体质量、身高和体质量指数对BMD的影响后,在各年龄组男性中Tru9 I不同基因型组间与腰椎、股骨近端部位的BMD值未见明显差异(P>0.05).因此VDR Tru9 I基因位点多态性分型对男性BMD的关系尚不明确,其基因型的检测对骨质疏松症发病机制的研究尚待展开更大样本的调查.     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。