中国美利奴羊BMP4基因的克隆、序列分析与真核表达

本实验利用RT-PCR技术获得妊娠105 d胎羊皮肤组织c DNA,PCR扩增获得中国美利奴羊BMP4基因全长编码区序列(CDS),将其克隆到zero PCR@TM-Blunt载体进行测序验证。获得的BMP4基因亚克隆至pc DNA3.1载体,构建绵羊BMP4真核表达载体,经脂质体2000转染293T细胞进行BMP4重组蛋白表达,Western blot鉴定表达产物。结果表明:中国美利奴羊BMP4基因编码区包含1227 bp,编码409个氨基酸,与其它哺乳动物氨基酸相似性达到92%,其成熟肽羧基末端区域具有TGFβ家族保守区结构。Western blot结果显示,重组蛋白分子量约为47KD,与预期一致,并证实人源BMP4单克隆抗体能够应用于羊BMP4研究。这为进一步的研究奠定了必要基础。     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

甘蓝型油菜Tic21基因克隆、表达及拷贝数鉴定

根据拟南芥Tic21基因编码区设计引物,在甘蓝型油菜中扩增并克隆到其cDNA同源基因,命名为BnTic21(GenBank登录号HQ613273),测序结果显示该基因含有5个外显子,4个内含子,cDNA编码区大小为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白理论分子量约为31.24kD,等电点11.10.与拟南芥、豌豆等物种氨基酸序列相似性在60.40%～87.75%之间.实时定量PCR对其不同组织特异性表达分析表明:BnTic21在油菜不同部位均有表达,茎尖最高,子叶、真叶、下胚轴次之,根表达量最低.用实时定量PCR检测表明BnTic21在甘蓝型油菜基因组中约有2个拷贝.     

藏绵羊脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、T-A克隆技术获得了藏绵羊H-FABP基因, 并对克隆序列进行分析. 结果显示, 藏绵羊H-FABP编码基因全长402bp, 编码133个氨基酸. 将藏绵羊H-FABP基因及氨基酸序列分别与Gene Bank中公布的山羊、水牛、家牛、野牦牛、猪、马、狗7种动物进行序列一致率比对, 结果显示, 藏绵羊与所选的7种动物的H-FABP基因序列一致率在90.8%～99.5%之间, H-FABP氨基酸序列一致率在93.2%～100%之间. 其中, 藏绵羊与藏山羊H-FABP基因存在2个位点核苷酸差异:114位碱基位点A→G和第129位碱基位点T→C, 但两个位点的核苷酸差异均为同义密码子, 藏绵羊与山羊H-FABP氨基酸无差异.     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.     

中国美利奴细毛羊BAC文库的质量评价

从文库的平均插入片段大小、文库的覆盖率、文库克隆的稳定性对中国美利奴细毛羊BAC文库进行了质量评价.统计结果表明,文库的平均插入片段大小约为133kb, 非重组克隆占3.2%,文库在理论上约有8倍绵羊基因组覆盖率,从该文库中找到任意单拷贝序列的概率为99.93%.连续多次传代培养实验证实文库克隆的遗传稳定性好.     

藏绵羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达的研究

为研究藏绵羊角蛋白相关蛋白(KAP3.2)基因结构与功能,揭示该基因的组织特异性表达规律.以藏绵羊为研究对象,分别提取藏绵羊心、肝、脾、肾及皮肤组织中总RNA,并以此为模板,通过RT-PCR技术对藏绵羊KAP3.2基因的c DNA进行克隆、序列分析;利用Real-time PCR技术进行组织表达研究.结果表明:藏绵羊KAP3.2基因编码区全长297bp,编码98个氨基酸;藏绵羊与普通绵羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人的相应核苷酸同源性分别为99%、97%、96%、79%、75%、73%;藏绵羊KAP3.2基因在皮肤中高表达,而在其它组织中相对表达量较低,说明该基因的表达具有组织特异性.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA进行克隆、序列分析,并采用Real-time PCR技术对其在发情前期母羊卵巢组织的表达进行研究.结果表明:山羊ZP3基因编码区全长为1269bp,共编码422个氨基酸,两品种间有2处碱基差异,但未导致氨基酸的差异.山羊的ZP3基因在卵巢表达量高,与其他组织差异极显著(P＜0.01),但两个品种间差异不显著(P＞0.05).说明ZP3基因主要在卵巢中表达,但可能不是影响山羊多羔性状的主基因.     

山羊Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对单胎藏山羊和多胎金堂黑山羊Apaf-3基因cDNA克隆、序列分析及组织表达特性研究.采集5只多胎金堂黑山羊和5只单胎藏山羊在发情期的卵巢、垂体等组织样,进行Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析,并采用定量PCR技术对其mRNA进行组织表达量研究.结果,克隆出山羊Apaf-3基因长度为1731bp编码区全长为1245bp,编码414个氨基酸.Apaf-3基因在两种山羊中序列相同,且在5种组织中的表达均无差异.同源性分析表明凋亡基因Apaf-3在动物的进化中保守性低,与山羊多羔性状的相关性需要进一步研究.     

牛结核分枝杆菌PstS3基因克隆与序列分析

以牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）基因组DNA为模板,克隆PstS3基因,并进行序列测定,然后利用生物信息学软件对其序列进行分析.结果显示,PstS3基因全长1 113 bp,编码370个氨基酸,与GenBank所发表的人结核分枝杆菌PstS3基因的核苷酸同源性为99.82%,氨基酸同源性为99.4%,有1处位点发生有义突变.     

微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

蒙古鮊ob基因的克隆与组织表达特异性的初步研究

根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,通过运用RT-PCR技术首次从蒙古鮊脂肪组织的RNA中扩增获得ob基因片段,并经序列分析证实为ob基因编码区438 bp的序列.不同物种同源性比较表明ob基因序列具有很高的保守性:蒙古鮊与人、猪和鼠的ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82.9%、84.0%和99.1%;蒙古鮊ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、猪和鼠氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.9%.用RT-PCR技术分析组织ob基因的表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中的表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中的表达量次之,在肾脏中仅微量表达,而在精巢和肠道组织中则不表达.     

绵羊RARG基因组织表达规律的研究

根据GenBank中报道的绵羊视黄酸受体γ（retinoic acid receptor—gamma，RARC）基因mRNA序列，设计特异性引物，利用Real—time PCR技术对绵羊RARG基因的组织表达规律进行了研究，并对其进行了生物信息学分析，为进一步研究该基因的功能提供线索。结果表明，绵羊RARG基因共编码458个氨基酸，其中亮氨酸所占比例最高，为11．10％；该基因编码产物在系统进化树中与牛的亲缘关系最近；RARG基因编码产物二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主，主要位于细胞核中，是一种水溶性蛋白；Real—time PCR结果显示，绵羊RARG mRNA在心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、十二指肠、淋巴、下丘脑、垂体、肌肉、睾丸等12个组织中均有表达，其中在睾丸中表达量最高，推测绵羊RARG基因可能参与机体繁殖机能的调控。     

水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及检测

以水稻（粳稻）cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的全序列,ORF区编码含535个氨基酸的蛋白,具有磷酸盐转运蛋白保守的蛋白激酶C作用位点、N端糖基化位点与酪蛋白激酶Ⅱ作用位点Southern blot分析显示此基因在水稻基因组中具有多个拷贝,与水稻基因组序列分析结果一致Westernblot预测目的基因表达的蛋白大小约为57．7ku．该基因的真核表达研究正在进行中．     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoosPermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL,基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现黄牛DAZL,基因cDNA全长2509 bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%一94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序(RRM),DAZ重复基序,Pumilio一2和PABP作用位点.RT-PCR结果显示b-DAZL,基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL,基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.     

鲈鱼cxcr4 cDNA克隆和序列分析

趋化因子受体(cxcr4)是一类重要的免疫调节因子受体,对原始生殖细胞的迁移和存活具有十分重要的作用。在对脊椎动物cxcr4进行初步生物信息学分析基础上设计引物,采用RT-PCR和RACE相结合的方法从鲈鱼卵巢克隆了cxcr4a全长和4b部分cDNAs序列,并预测其编码的氨基酸序列。结果表明,由于鱼类基因组经历一次特有的复制,cxcr4在鱼类存在两个复制基因。鲈鱼cxcr4a cDNA全长为1432 bp,编码311个氨基酸;cxcr4b部分cDNA片段长为905 bp,编码285个氨基酸。将鲈鱼cxcr4序列与所有已克隆的硬骨鱼类进行同源性比较,结果显示硬骨鱼类保守性较高,所有已经克隆的cxcr4按照进化地位的不同成簇聚类,表现出了较高的同源性。     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoospermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现：黄牛DAZL基因cDNA全长2509bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%—94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序（RRM）,DAZ 重复基序,Pumilio-2 和PABP 作用位点.RT-PCR结果显示：b-DAZL基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.