嗜水气单胞菌感染暗纹东方鲀脾脏的蛋白质组学分析

为了解暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)受到病原菌感染后参与应答的主要蛋白的功能与调控作用,采用TMT标记、高效液相色谱(HPLC)分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术,分析了暗纹东方鲀感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)12 h后脾脏组织的蛋白表达水平,鉴定差异表达蛋白,并通过亚细胞定位、GO(Gene Oncology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达蛋白进行进一步分析.本次实验共鉴定到306个差异表达蛋白,其中120个上调表达蛋白,186个下调表达蛋白;利用平行反应检测实验(PRM)对4个(1个上调,3个下调)与免疫相关的差异蛋白进行验证,其结果与蛋白质测序结果一致;亚细胞定位结果显示:差异表达蛋白主要定位在细胞质、细胞核和胞外;GO分析发现:差异表达蛋白参与的主要生物进程有代谢过程、细胞进程和单一生物进程,主要的分子功能有结合、催化活性和机构分析活性;KEGG通路分析结果显示:差异表达蛋白主要参与了核糖体、视黄醇代谢、卟啉和叶绿素代谢、ECM受体相互作用、吞噬体、叶酸生物合成、药物代谢、酪氨酸代谢等通路.研究结果为进一步探究病原菌感染暗纹东方鲀的致病机理提供了一定的理论基础.     

杜仲提取物对鱼类病原菌作用的研究

采用二次水浸提法提取杜仲有效成分进行杯碟法抑菌试验.结果表明,杜仲提取物对嗜水气单胞菌、鳗弧菌、温和气单胞菌具有较好的抑菌效果,而对大肠杆菌的抑菌效果不明显.通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析病原菌在杜仲提取物作用下蛋白的差异表达,结果发现,药物抑菌效果越明显的菌种,其蛋白表达的差异性就越大,且受抑制的蛋白和诱导表达的特异蛋白的分布比较广;而抑菌效果较差的菌种,其蛋白表达差异性较小.     

雷竹SOC1蛋白原核表达及纯化

为了获得有活性的雷竹PvSOC1蛋白(Phyllostachys violascens SUPPERSSOR OF CO OVEREXPRESSION 1),并进一步讨论其结构形态,通过原核表达方法得到PvSOC1的可溶性重组蛋白,以pET-GST作为表达载体,大肠杆菌E.coli Rosetta作为宿主菌株,超表达全长和IKC结构域的雷竹PvSOC1蛋白。发现在37℃条件下,菌液浓度D(600)值达到0.4～0.6时进行诱导,控制IPTG终浓度为0.4 mmol/L,诱导目的蛋白表达5 h,可以获得可溶的IKC结构域GST融合蛋白。采用TEV(tobacco etch virus protease)酶切技术、配合GST亲和层析柱及分子层析色谱柱,去除标签蛋白并纯化目的蛋白。所获得的高纯度IKC结构域PvSOC1蛋白经过对比分析发现其以八聚体形式存在。     

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.     

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Tpr的表达、纯化和初步晶体学研究

牙龈卟啉单胞菌是一种能够引起牙周炎的口腔病原菌,能够分泌许多种蛋白酶.这些蛋白酶在获得营养、逃脱宿主免疫、粘连组织细胞和其它疾病进程中发挥了重要作用,被认为是牙周炎的重要致病因子.其中一种蛋白酶是巯基蛋白酶Tpr,它能够降解许多常见蛋白酶的底物,其活性受到营养状态和钙离子浓度的调节.本实验在大肠杆菌中表达得到Tpr蛋白,经多种方法纯化后筛选获得蛋白质晶体.通过X射线衍射实验收集到分辨率达到0.20 nm的衍射数据,并使用软件HKL2000进行了处理.这些数据为解析Tpr3维晶体结构奠定了基础.     

MBP-PTP19融合蛋白载体构建及蛋白纯化

蛋白磷酸酶在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用.酪氨酸蛋白磷酸酶属于蛋白磷酸酶中一个亚家族,在植物领域的研究中涉及较少.笔者所在实验室研究数据表明,酪氨酸蛋白磷酸酶19(PTP19)在植物盐响应中起负调控作用.使用MBP标签载体,构建MBP-PTP19融合蛋白表达载体,转化BL21大肠杆菌.以IPTG浓度、诱导时间、诱导温度3个因素设计L18正交实验探索MBP-PTP19蛋白的最佳诱导表达条件.找到该蛋白表达的最适诱导条件为IPTG终浓度0.1mmol/L、诱导时间4h、诱导温度37℃.该融合蛋白在上清液以及包涵体中均有分布.用直链淀粉树脂纯化得到了MBP-PTP19蛋白,并以其为抗原制备了PTP19的抗体,且抗体可识别PTP19蛋白,这为研究PTP19蛋白生化性质及其功能奠定了基础.     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

重组鲑鱼降钙素融合蛋白工程菌发酵工艺研究

为研究大肠杆菌表达重组鲑鱼降钙素融合蛋白(GST-sCT-Gly)工程菌的发酵工艺,采用瑞士比欧生物工程公司40 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化;在优化条件下,以40 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达到57 g/L,目的蛋白表达量占总蛋白的23.5%;结果表明,研究确定的发酵工艺可以提高工程菌收获量及目的蛋白的表达量,且稳定可靠,可应用于生产。     

牙龈癌PTEN基因启动子区甲基化状态与鳞癌分级的分析研究

探讨第10号染色体丢失性的磷酸酶——张力蛋白同源基因(PTEN)启动子甲基化水平和蛋白表达水平与牙龈癌癌症细胞分化程度的关系。用甲基化特异性PCR法检测牙龈癌组织中PTEN基因启动子甲基化的状态,免疫组化法检测石蜡组织中PTEN的蛋白表达情况。结果牙龈癌组织中发生PTEN基因甲基化的频率为56.67%,其中高分化组甲基化频率为20%,中分化组为50%,低分化组为100%,组间差异具有统计学意义(P0.05),PTEN甲基化频率与其细胞分化程度密切相关。说明牙龈癌中PTEN基因可出现启动子甲基化,且低分化组牙龈癌PTEN甲基化频率更高,同时细胞内PTEN蛋白表达显著下调甚至缺失,为牙龈癌的靶向治疗提供线索。     

HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β/Fc蛋白的条件优化

为优化HEK293F细胞瞬时转染条件,提高PDGFR-β的蛋白表达量,采用聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)为转染试剂,将质粒p XLG-PDGFR-β/Fc与PEI混匀聚合后加入到细胞悬液,37℃,φ=6%CO2,180 r/min悬浮振荡培养,培养7 d后收集样品,ELISA检测PDGFR-β蛋白的浓度。对细胞密度、DNA浓度和m(DNA):m(PEI)、聚合时间以及添加物(丙戊酸钠、葡萄糖和蛋白胨)进行优化。结果显示,HEK293F细胞瞬时转染的最佳条件为:细胞密度4×106cells/m L、DNA浓度2.0μg/106cells、m(DNA):m(PEI)为1:2、聚合时间5 min。同时,48 h内添加3 mmol/L丙戊酸钠,第3天补加葡萄糖和1 g/L的蛋白胨TN1可使PDGFR-β/Fc的蛋白表达量明显提高。实验表明,经过对HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β的转染条件的优化,蛋白表达量可达55 mg/L,为更大规模瞬时转染生产PDGFR-β/Fc蛋白奠定了基础。     

Preparation of the selenomethionine derivative of tabtoxin resistance protein

In order to obtain phase information for the X-ray diffraction of tabtoxin resistance protein (TTR) crystal using the MAD phasing method, a selenomethionine (Se-Met) derivative of TTR was overexpressed in E. coli strain M15, with pQE-30 plasmid, through IPTG induction in M9 medium containing Se-Met. The product was purified to an estimated homogeneity of greater than 95% according to SDS-PAGE, by a Ni-NTA metal affinity followed by a Mono Q anion exchange column chromatography. The successful substitution of Se-Met for methionine (Met) was confirmed by MALDI-TOF and ESI-Quadrupole Mass Spectrometry analysis. The derivative crystal was obtained using similar conditions as those for the native.     

沉淀吸附法提取苦丁茶中的熊果酸

依次用碱和酸作沉淀剂,D型树脂作吸附剂,研究了用沉淀-吸附法提取苦丁茶中中熊果酸的工艺.得到的优化条件为:将苦丁茶的乙醇提取液用质量分数为10%的NaOH溶液碱化至pH值约为10.96,过滤除去多酚等杂质,沉淀后,滤液先用体积分数为10%的H2SO4酸化至pH值为4.00,再用相同体积的pH值为4.00的酸性水溶液稀释,得到熊果酸沉淀粗产品;粗产品用甲醇溶解后,将样品溶液pH值调整为7.07,洗脱液pH值调整为11.0,用D型大孔树脂吸附,分步洗脱,收集体积分数为90%乙醇溶液的洗脱液,浓缩结晶得到熊果酸产品.采用高效液相色谱法测得沉淀分离后产品纯度为23.12%,回收率为92.90%;吸附分离后产品纯度为90.23%,回收率为98.02%,总回收率为89.09%.     

反相微乳液制备无单体残留阳离子聚丙烯酰胺

以丙烯酰胺(AM)和二甲基二烯丙基氯化铵(DMDAAC)水溶液为水相,失水山梨醇单油酸酯(Span80)/聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯(Tween60)/异构烷烃Isopar M为油相,过硫酸铵/亚硫酸氢钠((NH4)2S2O8/Na HSO3)为引发剂,在40℃进行反相微乳液聚合制备阳离子聚丙烯酰胺P(AM-DMDAAC).通过红外光谱(IR)、液相色谱(LC)、扫描电镜(SEM)对共聚物结构、丙烯酰胺单体残留量及表面形貌进行表征分析.结果表明,在40℃,HLB值为8.5,AM与DMDAAC质量比为8∶2,引发剂占单体总质量的0.7%,乳化剂占油相总质量的25%时,得稳定透明的微乳液,产物为无单体残留阳离子聚丙烯酰胺共聚物,阳离子度为30%.     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

脂蛋白酯酶的分离纯化及其部分性质研究

将Candida rugosa用橄榄油诱导培养,所得上清液依次经过截留分子量10 000中空纤维柱浓缩,85%硫酸铵沉淀,然后经过DEAE-Sepharose F.F.离子柱和Phenyl Sepharose CL-4B柱进行交换层析和疏水层析,得到了活力达6.04 U/mg的脂蛋白酯酶,纯化倍数和回收率分别为13.8倍6.6%。所得纯化酶经还原和非还原SDS-PAGE分析为单一蛋白染色带,HPLC显示纯度为95%以上。该酶的最适温度为40℃～50℃之间,最适pH为7.5,具有较强的热稳定性和酸碱稳定性,在最适温度和pH条件下该酶Km值为3.4×10-4mol/L。     

The strict anaerobe Bacteroides fragilis grows in and benefits from nanomolar concentrations of oxygen

Strict anaerobes cannot grow in the presence of greater than 5 micro M dissolved oxygen. Despite this growth inhibition, many strict anaerobes of the Bacteroides class of eubacteria can survive in oxygenated environments until the partial pressure of O2 (PO2) is sufficiently reduced. For example, the periodontal pathogens Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis colonize subgingival plaques of mammals, whereas several other Bacteroides species colonize the gastrointestinal tract of animals. It has been suggested that pre-colonization of these sites by facultative anaerobes is essential for reduction of the PO2 and subsequent colonization by strict anaerobes. However, this model is inconsistent with the observation that Bacteroides fragilis can colonize the colon in the absence of facultative anaerobes. Thus, this strict anaerobe may have a role in reduction of the environmental PO2. Although some strictly anaerobic bacteria can consume oxygen through an integral membrane electron transport system, the physiological role of this system has not been established in these organisms. Here we demonstrate that B. fragilis encodes a cytochrome bd oxidase that is essential for O2 consumption and is required, under some conditions, for the stimulation of growth in the presence of nanomolar concentrations of O2. Furthermore, our data suggest that this property is conserved in many other organisms that have been described as strict anaerobes.     

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白

通过层析实验，比较了几种阴离子交换剂在不同温度、pH值、离子强度、进样流速、进样浓度下对人血清白蛋白的吸队与脱附性能，研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力，并考察了桩层析过程中吸附载体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性，实验结果表明：版号为DEAE Sepharose FF的载体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度，而且有较高的回收率。     

人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
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头孢呋辛酯在丙酮溶液中的降解动力学研究

为了研究头孢呋辛酯丙酮溶液的稳定性,应用高效液相色谱,采用单因素方式考察初始溶液pH值、温度、氧化剂种类等条件下,头孢呋辛酯在溶液中的含量随时间的变化规律,依据化学反应动力学方法建立得到了头孢呋辛酯在不同条件下的降解反应动力学模型,回归得到了模型参数、预测半衰期(t_(1/2))。利用Materials Studio模拟软件从分子尺度对头孢呋辛酯的降解机理进行了分析。结果表明:头孢呋辛酯丙酮溶液的降解符合一级反应动力学;pH值9.54时头孢呋辛酯丙酮溶液基本稳定,pH值≥9.54时其化学稳定性变差,随着pH值的增大降解速率迅速加快、溶液颜色加深;头孢呋辛酯丙酮溶液的化学稳定性随温度的升高而变差。研究结果可为相关产品的生产过程、结晶工艺设计、存储和应用提供数据支撑。     

水胺硫磷的高效液相色谱分析方法研究

本文研究了用高效液相色谱法测定新型杀虫剂水胺硫磷的方法。在反相ODS柱上,以甲醇、水作流动相,邻苯二甲酸二丁酯作内标定量,紫外检测器检测。这种方法快速、准确、灵敏,线性范围宽,最小检测量1.0ng,相对标准偏差0.63%。平均回收率99.44%。