大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

中药材羌活鱼引物特异性PCR鉴定

应用引物特异性PCR技术的原理和方法,根据已有Cyt b基因DNA序列的比对结果,设计可以特异扩增羌活鱼源动物包括山溪鲵属Batrachuperus的全部物种的PCR引物1对,SXNS1(上游引物)5′-GGGTCTGCTTAATCTCACAAATTAT-3′,SXNS2(下游引物)5′-CAATTA AAAATGGGAATAAGAAATG-3′.结果表明该对引物可以用于正品羌活鱼和混伪品的分子鉴定.     

微卫星标记在人参和西洋参鉴别中的应用

从GenBank中寻找含有简单重复序列(SSR)位点的人参DNA片段序列,设计SSR引物,挑选PCR扩增条带清晰的引物,对人参和西洋参进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,选择能够区别2个种的引物.共有来自8个SSR位点的9对引物能扩增出可区分人参和西洋参的特异性片段,其中7对SSR引物在西洋参中能稳定地扩增出特异性...     

一株嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的16S-23S rDNA间区序列分析及应用

根据细菌的16S rDNA 3'端和23S rDNA 5'端的高度保守区设计引物,扩增了一株中华鳖Trionyx sinensis"红板病"病原菌--嗜水气单胞菌的16S-23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序.用BLAST和DNAstar软件对16S-23S rDNA间区序列以及其内tRNA基因与已发表的嗜水气单胞菌和近缘种的IGSG序列进行比较分析,设计出对嗜水气单胞菌特异的PCR引物,建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法,进行了特异性、灵敏性检测,并用此方法检测了不同的水样.     

以 16S-23S rDNA 间区序列为目的基因设计 PCR 引物鉴定多杀巴斯德氏菌

多杀巴斯德氏菌是养殖动物(鸡,猪,牛等)的重要致病菌.本研究以16S-23S rDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌.通过对多杀巴斯德氏菌ITS-IA(含有tDNA-Ile和tDNA-Ala的16S-23S rDNA间区序列)的测序和与GenBank中序列的BLAST,设计筛选了一对特异引物PS-F/PS-R.对引物的特异性和有效性,用PCR方法进行了验证.结果表明:所有的多杀巴斯德氏菌标准菌株和分离菌株都能被检出,而全部39株非多杀巴斯德氏菌都没有扩增出特异性条带.其检测灵敏度能达到102CFU/mL.研究结果表明,发展了的PCR鉴定方法是省时的和可靠的,整个过程只需要20 h,而传统的鉴定方法需要至少5 d的时间.     

线粒体COⅢ基因分析三种常见鲳鱼的亲缘关系

金鲳(Trachinotusovatus)、银鲳(Pampusargenteus)和中间低鳍鲳(Peprilusmedius)是重要经济鱼种,其中后两种鱼外形较为相似,分类一直存在分歧.本研究随机采集烟台、青岛地区银鲳、中间低鳍鲳和金鲳的生鲜海鱼样本,提取3种鱼的全基因组DNA,设计通用引物对目标基因进行PCR扩增和测序,后对其线粒体COⅢ全序列及ATP6部分序列进行基因多态性分析,探讨3种鱼的亲缘关系;依据测序结果,设计各鱼种的特异引物,用特异引物和通用引物进行复合PCR扩增方法对各鱼种进行种源性鉴定.通过比对分析测序结果,获得了中间低鳍鲳COⅢ基因全序列及ATP6基因部分序列且收录在NCBI核苷酸数据库中,登录号分别为KT210112和KT210113.证明NCBIGenBank中发布的刺鲳(Psenopsis anomala)序列(KP334103.1)实为中间低鳍鲳.遗传距离分析发现银鲳与金鲳的距离最大,与中间低鳍鲳次之,中间低鳍鲳与金鲳的遗传距离最小.采用复合PCR方法,实现了在同一复合PCR体系中有效区分3种鱼的方法,具有更加便捷、准确的优势.     

基于兼并引物的PCR扩增特定基因的效果比较

根据NCBI上的DNA拓扑异构酶Ⅱ基因序列设计兼并引物,采用常规PCR、降落PCR、巢式PCR三种方法扩增糙皮侧耳和阿魏侧耳的拓扑异构酶Ⅱ部分基因序列,比较三种方法扩增效果的特异性、灵敏度.结果表明,巢式PCR的灵敏度和特异性都优于常规PCR和降落PCR,并且巢式PCR的灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍以上,更加适合兼并引物扩增.这对利用兼并引物获取特异基因具有指导意义.     

细叶石斛的位点特异性PCR鉴别

根据细叶石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS 序列,我们设计了位点特异性PCR鉴别引物 XY-JB01S和XY-JB01X,对细叶石斛进行了成功的DNA分子鉴别.在进行位点特异性鉴别PCR之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃, 只有细叶石斛的模板DNA 能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别细叶石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.     

分子生态学方法对油藏细菌群落结构分析的比较

目前对油藏细菌群落结构分析方法繁多,为得到准确全面的群落分析结果,必须选取合适的方法。群落分析方法的优劣进行比较分析,选取从新疆陆梁油田注水井筛出的11株单菌,测定其16srDNA序列,制成包含7个菌属、9个菌种的混合菌液。应用基于PCR扩增的三种分子生态技术DGGE、T-RFLP、建立16SrDNA文库比较和分析了混合菌液细菌多样性。使用PCR-DGGE方法时发现,DGGE方法可灵敏地检测到序列1 bp的变化,能将不同菌株分开,但该方法经过切胶测序后的的目标序列较短,信息量不大且有时有一定误差,较适合用于定性对比;而用于菌群结构的分析时应结合其他方法。T-RFLP法可区分大部分菌属,但数据库不够完整,不能确定细菌群落组成;因此也不适合单独用在细菌群落检测中,可用作多个样品种群多样性的对比或结合其他方法对样品进行系统透彻解析。建立16srDNA克隆文库法成功鉴定到7个菌属8个菌种16SrDNA序列,更适用于油藏细菌群落结构的分析。     

中华鳖病原菌菌种的分离鉴定及多重PCR的初步建立

对患病中华鳖心脏、肝脏、肠道中分离得到的疑似致病菌株进行常规生理生化鉴定,同时采用分子生物学鉴定方法,设计细菌16srDNA保守区通用引物,进行基因扩增及序列比对,建立并优化多重PCR反应条件.分离鉴定出4种病原菌:迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,Et)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii,Cf).多重PCR检测体系敏感性与特异性良好,证明多重PCR是一种能快速准确鉴定多种中华鳖致病菌的方法,且操作简单、灵敏度高、稳定性和重复性好.     

武汉东湖PP类噬藻体的遗传多样性研究

设计出一对特异性扩增噬藻体PP序列的引物159B,利用该引物对若干季节的武汉东湖不同湖区的PP类噬藻体进行PCR扩增和PCR产物直接测序.结果表明:PP类噬藻体PcR扩增序列的差异不大(最大不超过12%),推测环境中PP类噬藻体的遗传多样性较为稳定.     

中药材桔梗及其易混品的DNA条形码分子鉴定

为了特异性地鉴别桔梗药材Platycodon grandiflorum及其易混品,通过优化DNA提取方法,并基于ITS(internal transcribed spacer)序列上的特异性位点,设计特异性引物,进行特异性PCR扩增,以扩增成功率为判定指标快速鉴别桔梗药材真伪.研究结果表明,改良CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法提取DNA较纯且100%扩增成功;基于桔梗293位和538位的特异性位点,设计特异性引物U1/D1,且特异性PCR鉴别中,仅桔梗能扩增得到约 264 bp 的特异性条带,其他药材均为阴性扩增.ITS序列以及特异性引物可准确鉴别桔梗及其常见易混品,为桔梗药材的基原鉴定提供科学依据.     

利用抑制性PCR提高兼并引物扩增效率及特异性

为提高兼并引物PCR的特异性和扩增效率,改进了兼并引物的设计,在兼并引物上加入接头序列,使其延长,并利用该方法成功获得了一个新的聚酮类合成酶的基因片段,表明抑制性PCR能够提高兼并引物扩增的效率及特异性.     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

应用3’RACE技术扩增仿刺参C型凝集素基因及实验条件的优化

从GenBank上调取刺参C型凝集素（C-type Lectin）基因序列EST,根据此序列设计RACE引物,采用PCR扩增技术得到了仿刺参C-type Lectin基因序列（EST）,根据这段EST序列设计1个基因特异引物（GSPF）,与通用引物（UPM）扩增,成功地克隆到了该基因的3’末端序列.同时,对仿刺参C型凝集素基因3’克隆的实验条件进行了优化.该扩增片段长度为670bp,与已知序列重叠部分为417bp.经测序和比对发现该段序列与预期的目标基因的序列一致.     

单因子和正交设计法建立分枝杆菌多重PCR体系

为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重PCR方法,以分支杆菌属特异基因32kD,结核分枝杆菌种特异基因MTP40和结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110为目标基因,设计合成3对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株DNA为模板,通过对PCR反应体系中DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度5个因素的正交设计,以及PCR反应条件中各反应参数的优化,建立了鉴别分支杆菌的多重PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了验证。结果显示:该方法对结核分枝杆菌标准株H37Ra能扩增出506、396和984bp,对卡介苗(BCG)能扩增出506和984bp片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出506bp片段,对大肠杆菌等的扩增结果均为阴性。建立的多重PCR敏感度最低可检出6.6×10-6 ng。结论:该方法具有特异性高、敏感性好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。     

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS序列，设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC—JB01S和DC—JB01x，并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别．在进行位点特异性PCR鉴别之前，首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增，以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度．当退火温度上升为64℃，只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来，而其它的37种石斛属植物均为阴性．该鉴别反应重复性好，已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用．与DNA测序鉴别方法相比，位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点．     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

一种DNA侧翼序列分离技术--TAIL-PCR

在分子生物学研究中，基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列，热不对称交错PCR(简称TAIL—PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL—PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔综述了TAIL-PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。     

鸡白痢沙门氏菌直接-多重PCR检测体系的建立

通过对鸡白痢沙门氏菌毒力质粒pSPUV上入侵质粒抗原J蛋白和质粒共转移调控因子的编码基因ipaJ和traJ的序列分析,在特异区域设计PCR引物,经沙门氏菌属不同种及常见肠道致病菌的交叉验证,筛选出三对鸡白痢沙门氏菌特异检测引物ipaJ-417、traJ-387、traJ-476.并且调试出一种利用两种DNA聚合酶的直接三重PCR检测体系:invA-211/traJ-387/16S-495,可以对鸡白痢沙门氏菌进行快速准确的鉴定.