花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

利用AFLP-银染法筛选与抗甘蓝黑腐病性状连锁的分子标记

利用ＡＦＬＰ－银染法在一对花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中筛选到四个与抗黑腐病性状、一个与感黑腐病性状连锁的ＤＮＡ 分子标记．对其中一个４００ｂｐ 的抗病标记进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测,结果表明该标记在抗病品系中存在明显的杂交信号,而在感病品系中无杂交信号．该标记测序后,通过Ｇｅｎｂａｎｋ 进行同源性检测,发现其与拟南芥菜ＢＡＣ克隆Ｆ７Ｎ２２ 部分序列有７５％ 的同源性．该ＢＡＣ克隆位于拟南芥菜５ 号染色体的黑腐病抗性基因（ｒｘｃ２）附近．这意味着该标记可能与甘蓝黑腐病抗性基因紧密连锁．     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731(感病系)和C712(抗病系)作为材料,利用cDNA-AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况.获得了两个阳性克隆M2和M6.Nprthern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同.而M6是差异表达的cDNA片段.Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列.随后的序列分析发现M6 cDNA片段与拟南芥1号染色体的BAC F19P19中66 665～66 813 bp有84%同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列.推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91%同源性.用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现:M6 cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24 h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势.根据序列分析和初步的功能分析的结果推测:M6 cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段.是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段.     

与花椰菜(Brassica oleracea ssp.botrytis)抗黑腐病基因连锁的RAPD标记

利用 RAPD技术 ,在花椰菜 ( Brassica oleracea ssp.botrytis)抗感黑腐病的近等位基因系之间进行 1 0碱基随机引物的筛选 .34 5条 RAPD引物扩增的产物表明 ,有 7条引物在近等基因系中呈多态性 .进一步的重复实验表明 ,只有引物 OP2 2 4能够产生稳定的多态性 .为了确定扩增产物 OP2 2 4/1 6 0 0与抗黑腐病基因的连锁程度 ,利用 F2分离群体进行检测 ,结果表明 :花椰菜种质 C71 2抗黑腐病生理种 BJ的抗性由一对显性基因控制 .RAPD标记OP2 2 4/1 6 0 0与抗病基因连锁 ,其遗传距离为 ( 4 .5± 1 .37) c M     

多年生簇毛麦基因组Yr10全长同源序列的分离及鉴定

根据植物抗病基因保守结构域NBS(Nucleotide-binding site,核苷酸结合位点)、LRR(Leucine-rich repeats,富含亮氨酸重复)设计13条引物相互组合对多年生簇毛麦基因组总DNA进行PCR扩增,获得了小麦抗条锈病基因Yr10的全长同源序列DbRGAYr10,其序列全长为5615 bp,编码的氨基酸组成与其他已知的普通小麦(Triticum aestivum)、节节麦(Aegilops tauschii)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、高粱(Sorghum bicolor)、一粒小麦(Triticum monococcum)基因组内Yr10基因或抗性类似基因编码的氨基酸序列具有89~90%的同源性,且大部分氨基酸序列保守.序列分析表明DbRGAYr10为类NBS-LRR抗病基因,包含TATA-box等顺式作用元件.本研究为最终从多年生簇毛麦中发掘新的抗病基因和开展遗传转化获得新的抗病品种奠定了基础.     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

白菜快速碱化因子基因BcMF14的克隆及序列分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子．从一个在‘矮脚黄’白菜雄性不育两用系的可育株系中特异表达的cDNA—AFLP差异片段入手,采用RACE技术克隆了该片段的基因,将其命名为BcMF14,全长581bp,不含内含子,开放阅读框长度为240bp,编码79个氨基酸．序列分析结果表明该基因与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子基因cDNA序列有很高的相似性,证明BcMF14属于快速碱化因子家族．     

普通野生稻中NBS同源序列的克隆和分析

已知的植物抗病基因大多数具有核苷结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复（LRR）。根据NBS的保守区设计引物,应用聚合酶链式反应（PCR）,从普通野生稻基因组中克隆了4个不同的NBS同源序列（OSNBA1－OSNBA4）。同源性比较显示它们均与非TIR类的NBS序列相似,其中,OSNBA1与双子叶植物拟南芥的RPS2基因更接近;OSNBA2－OSNBA4与单子叶植物水稻的XA1、RPR1基因更相似。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．