小麦易位系基因组DNA甲基化分析中MSAP体系建立及应用

DNA甲基化在真核生物生长发育过程中起着重要调控作用.依据对DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶,在AFLP(amplified fragment length polymorphism)基础上发展而来的MSAP(methylationsensitive amplification polymorphism)技术可以方便的检测全基因组DNA胞嘧啶甲基化模式及程度.本文以一套高代分离的小麦黑麦1RS/1BL易位系及其亲本材料为研究对象,采用EcoRⅠ和HpaⅡ(或MspⅠ)双酶切建立适合于小麦易位系基因组的MSAP技术体系,针对研究中出现的问题提出解决方法,并对酶切位点的甲基化模式进行分析,检测易位系及亲本材料间的甲基化多态性,为进一步的基础研究和育种应用提供理论依据.     

一个植物跨膜蛋白DUF872基因家族新成员的克隆与序列分析

DUF872家族是由一些未被具体描述的真核生物蛋白质构成,该家族的基因功能尚不清楚.本研究通过PCR方法从手掌参全长cDNA文库中筛选到了一个DUF872家族基因的全长cDNA,暂命名GcDUF872-1或Gc364.测序表明该序列长度为618 bp,推测编码103个氨基酸的蛋白质,序列比对表明它与拟南芥和水稻的DUF872家族基因蛋白质的相似程度达到85.92%.DUF872基因家族的进化分析表明Gc364与水稻、拟南芥的遗传关系最近,同属一个亚家族.半定量RT-PCR显示Gc364在植物组织中表达量较低,属于低丰度表达的基因,而且表达量受光处理而上调.生物信息学分析表明预测蛋白Gc364属于两次跨膜的蛋白质,可能是一个真正的编码蛋白,主要参与信号传递或能量的转换.     

一个小麦-非洲黑麦染色体易位系的分子细胞学鉴定

为发掘和利用黑麦属野生种非洲黑麦(Secale africanum)所携带的优异基因,我们用四川栽培小麦与人工合成的硬粒小麦非洲黑麦双二倍体杂交回交,将分子标记技术应用于早期世代选择,结合染色体C带技术与基因组原位杂交技术,在BC1F5代获得了抗条锈病的新品系L15-,经鉴定它具有非洲黑麦的1R染色体与小麦1B染色体形成的1RS/1BL易位染色体,该易位系的获得增加了1RS/1BL易位系的遗传多样性,是研究非洲黑麦基因遗传和小麦抗病育种的新种质.     

簇毛麦3V和4V染色体特异分子标记的建立

选用100条ISSR引物对多年生簇毛麦(Dasypyrum breviaristatum)、不同居群的二倍体簇毛麦(D.villosum)、小麦多年生簇毛麦部分双二倍体(TDH-2)、二粒小麦多年生簇毛麦双二倍体(TDB-3)、硬粒小麦二倍体簇毛麦双二倍体(ABV)和6份小麦进行PCR分析.结果发现引物ISSR808和ISSR811均可以在含簇毛麦染色质材料中扩增出1条约900 bp的特异DNA带,而对照组小麦则没有相应带纹.对这两个特异片段进行克隆测序,发现其长度分别为860 bp和898 bp, 分别被命名为ISSR808860和ISSR811898.序列比对结果显示(1)ISSR808860与一粒小麦(Triticum monococcum)和大麦(Hordeum vulgare)基因组LTR反转录转座子部分序列同源性分别达到83%和81%(2)ISSR811898与普通小麦(riticum aestivum)Wknox1d基因的部分内含子序列具有88%的同源性.利用中国春簇毛麦附加系(CSDA1V-CADA7V)分别将ISSR808860定位在3V和4V染色体上, 将ISSR811898 定位4V染色体上.用ISSR808和ISSR811对多年生簇毛麦的大量衍生后代进行PCR分析,结果表明ISSR808860和ISSR811898可以作为检测簇毛麦3V和4V染色体的分子标记应用到辅助小麦育种工作中.     

多年生簇毛麦基因组Yr10全长同源序列的分离及鉴定

根据植物抗病基因保守结构域NBS(Nucleotide-binding site,核苷酸结合位点)、LRR(Leucine-rich repeats,富含亮氨酸重复)设计13条引物相互组合对多年生簇毛麦基因组总DNA进行PCR扩增,获得了小麦抗条锈病基因Yr10的全长同源序列DbRGAYr10,其序列全长为5615 bp,编码的氨基酸组成与其他已知的普通小麦(Triticum aestivum)、节节麦(Aegilops tauschii)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、高粱(Sorghum bicolor)、一粒小麦(Triticum monococcum)基因组内Yr10基因或抗性类似基因编码的氨基酸序列具有89~90%的同源性,且大部分氨基酸序列保守.序列分析表明DbRGAYr10为类NBS-LRR抗病基因,包含TATA-box等顺式作用元件.本研究为最终从多年生簇毛麦中发掘新的抗病基因和开展遗传转化获得新的抗病品种奠定了基础.     

外源种质导入引发小麦表观遗传变异的MSAP分析

通过染色体工程将外源种质向小麦基因组转移的过程中, 可以诱发受体物种基因组结构及基因表达的广泛遗传变异. 本文以3个高代分离的小麦-黑麦姊妹易位系及其农艺亲本为材料, 应用GISH和AFLP技术分析其基因组结构与组成, 发现姊妹系材料基因组组成高度一致; 同其亲本相比较, 除1RS/1BL染色体易位外, 并没有表现出其他明显的基因组结构变异. 进一步的MSAP分析发现, 易位系材料发生全甲基化修饰的比例比小麦亲本(全甲基化, 16.37%; 半甲基化, 25.44%)明显上升(CN12, 20.15%; CN17, 20.91%; CN18, 22.42%), 而半甲基化比例则明显下降(CN12, 21.41%; CN17, 23.43%; CN18, 22.42%). 本研究共检测到29种不同类型的甲基化修饰模式, 其中13种类型(33.74%)的位点表现为超甲基化修饰, 9种类型(22.76%)的位点表现为去甲基化修饰, 而余下7种类型(4.07%)的位点甲基化模式变异未能明确界定. 从中分离了多条存在甲基化位点变异的DNA序列, 鉴定了多种小麦转座子序列、亚端粒重复序列以及单拷贝蛋白质编码序列.     

偃麦草Ee染色体组特异DNA片段的分离、定位与应用

以中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、二倍体长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)、拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)和6个小麦对照为材料筛选240条10碱基RAPD引物. 结果发现引物H4在二倍体长穗偃麦草中扩增出1条长为740 bp的高拷贝DNA(记做Ee740),而小麦则扩增不出该片段.序列比对结果显示,Ee740位于散布重复序列与LTR反转录转座子athila之间,且仅与小麦基因组一个212 bp的片段有87%的同源性,因此Ee740应为一新DNA序列.根据Ee740设计特异PCR引物H4-F和 H4-R,对含E染色体组的材料和小麦材料进行扩增,结果显示,仅中间偃麦草和长穗偃麦草能扩增出Ee740.进而对1套中国春-倍体长穗偃麦草附加系(CS1E-S7E)进行扩增,结果发现仅CS2E、CS4E、CS5E、CS7E能扩增出Ee740, 即Ee740分布在偃麦草的2E、4E、5E和7E染色体上.进一步对小麦茸毛偃麦草的后代材料进行SCAR分析,结果表明Ee740可以用于小麦背景中Ee染色质的检测.