肺炎克雷伯菌第1类整合子的鉴定和耐药性分析

目的 了解来源于不同临床标本的肺炎克雷伯菌的耐药性、携带第1类耐药整合子的特征及基因盒的种类.方法 使用常规方法分离肺炎克雷伯菌;运用法国梅里埃VITEK细菌分析系统进行鉴定;应用纸片扩散法对15种抗生素进行耐药性监测和分析;应用PCR法扩增第1类整合子;对PCR产物纯化、测序,并对结果进行分析.结果 来源于不同临床标本的64株肺炎克雷伯菌100%耐药,32株(50%)表现多重耐药,9株耐4种抗生素,耐药谱为氨苄西林-链霉素-复方新诺明-四环素;20株(31.2%)为第1类整合子阳性株,其中17株整合子大小为1.0 kb,2株为1.6 kb,1株含有1.0 kb和1.6 kb两个整合子;PCR产物测序显示1.0 kb整合子携带pse-1-aadA1基因盒,1.6 kb整合子插入了pse-1-aadA2,pse-1-aacA1基因盒,双重整合子株插入了pse-1-aadA1和pse-1-aacA1基因盒.结论 第1类整合子存在于各种临床标本分离的肺炎克雷伯菌中,且与多重耐药性相关,主要决定着对β内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的耐药性.     

重症监护病房多重耐药铜绿假单胞菌Ⅰ型整合子的检测及鉴定

 整合子是介导细胞多重耐药的重要机制之一,鉴定了2008年某医院重症监护病房分离的23株多重耐药铜绿假单胞菌1型整合子,并应用脉冲场电泳分析其同源性。1型整合子的阳性率达成60.9%。3种1型整合子基因盒被鉴定,其中整合子blaOXA 10 acc6 Ⅱ cmlA8为首次发现报道。基因盒主要编码氨基糖苷类耐药基因,包括 aacA4, aadA2, aadB, aac6 Ⅱ。脉冲电泳结果表明,23株多重耐药铜绿假单胞菌分为5个基因型,A 型(n=5)、B型 (n=6)、C型 (n=4)、D型(n=2)和E型(n=2)。研究表明编码1型整合子是多重耐药铜绿单胞菌较为普遍的特征,且1型整合子与多重耐药表型存相关。研究结果同时也表明防止多重耐药铜绿单胞菌交叉感染仍然是ICU的一项挑战性工作。     

用PCR方法检测土壤中类鼻疽假单胞菌的研究

目的建立一种灵敏、特异的检测土壤中类鼻疽假单胞菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法用类鼻疽假单胞菌鞭毛蛋白的基因作引物,用PCR扩增的方法检测6种土壤中不同浓度的类鼻疽假单胞菌和3个假单胞菌属的3种对照菌.结果用鞭毛蛋白基因作引物的PCR方法具有高灵敏度,其他3种对照结果阴性.结论用类鼻疽假单胞菌鞭毛蛋白基因作引物建立的PCR方法为检测土壤中类鼻疽假单胞菌提供了科学依据.     

一株多氯联苯降解菌的分离鉴定及基因分型

从深海底泥中分离筛选出一株以多氯连苯（PCBs）为惟一碳源和能源生长的菌株, 命名为pdi. 该菌在含有PCBs 7.5 mg/L的150 mL液体培养基中培养7d, 用GC MS检测其对PCBs的降解率达95.38%. 以细菌16SrDNA通用引物对pdi基因组进行PCR扩增, 得到~1　500　bp的片段. 经纯化, 测序后在Genbank上进行同源性比较分析及系统发育树构建, 该菌与Pseudomonsa spTS1138同源性达100%, 初步鉴定该菌为假单胞菌属. 对pdi基因组进一步运用RAPD分子标记技术进行随机引物扩增基因分型, 获得了稳定的DNA 指纹图谱.     

应用RAPD技术研究金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌DNA的多态性

本试验利用RAPD技术对临床上重要的致病菌金黄色葡萄球菌28株和铜绿假单胞菌2l株，用10bp引物进行扩增，结果铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的DNA带谱均出现了多态性；根据带谱的不同可将铜绿假单胞菌分成8个型，金葡菌分成3个型；根据铜绿假单胞菌的带型计算各菌间的相似系数，依此系数绘制了系统树，从系统树中清晰可见各菌间的亲缘关系。     

一株新铜绿假单胞菌噬菌体SRT6的分离以及全基因组序列分析

分离一株新铜绿假单胞菌噬菌体,进行生物学特征分析,全基因组测序和比较基因组学分析.了解该噬菌体与其他假单胞菌噬菌体之间的亲缘关系以及它的潜在应用价值.利用双层平板法分离纯化噬菌体,利用酚氯仿抽提基因组,利用Illumina Hiseq测序平台对基因组测序,利用生物信息学进行基因组和比较基因组学分析.分离到一株新的烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,其基因组全长91 364bp,G+C含量49.3%,存在182个蛋白质编码基因,其中的96个与已知功能的蛋白质具有相似性,无tRNA和tmRNA.比较基因组分析发现,噬菌体SRT6属于一个新物种.分离鉴定出一株烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,并发现它属于一个新种噬菌体,为未来利用噬菌体治疗耐药铜绿假单胞菌感染打下坚实的基础.     

铜绿假单胞菌医院感染流行病学分子研究及基因分型

目的建立随机扩增多态性DNA（RAPD）基因分型方法检测铜绿假单胞菌（PA）,调查铜绿假单胞菌医院感染流行病学的情况,为控制院内感染提供直接可靠的参考依据。方法对2008—2009年分离的180株铜绿假单胞菌进行统计分析其临床分布;通过抗生素敏感性试验进行抗菌谱分型;再采用PAPD基因分型方法进行分析。结果标本主要来自ICU、烧伤科、呼吸内科等。从痰液标本中分离的铜绿假单胞菌占58．9％,其次伤口分泌物标本占18．9％、中段尿16．7％,其它类型标本占5．5％。抗菌谱分型分为5型。180株铜绿假单胞菌用RAPD分型共得178株,分型率98．9％（178／180）,分为9种类型：Ⅰ～Ⅸ。结论RAPD分型技术对铜绿假单胞菌临床分离株分型率较高;同一抗菌谱型的基因型可能不同,同一基因型的抗菌谱也可能不同。     

采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的初步研究

初步探讨了采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的方法.根据已知细菌16S rDNA序列的高度保守区设计引物,利用PCR法扩增16株已鉴定的鳗鲡病原菌的16S rDNA片段,测序分析后,通过Gen-Bank数据库进行同源性检索,并构建相应的系统发育树.结果表明:16株鳗鲡病原菌均扩增到了400 bp左右的基因片段,其中14株菌的16S rDNA片段序列与网上已发表的同属菌株的同源性为100%,其余2株为99%;8株病原菌被鉴定到种,分别属于嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,其余8株被鉴定到属,分别属于气单胞菌属、假单胞菌属和肠杆菌属;鉴定结果与生化鉴定结果在属的分类单元上的符合程度高达82%.     

假单胞菌褐藻胶裂合酶活性片段的基因克隆及重组表达条件的优化

为分析假单胞菌（Pseudomonas）膜周质中褐藻胶裂合酶（alginate lyase,AlgL）的最小活性单元,进行了活性片段的初步研究.用简并引物克隆MY01菌株中AlgL基因的片段,用特异引物扩增目的序列并克隆入pBAD gⅢ/A载体,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆.进行L-阿拉伯糖诱导表达条件的优化,超声破碎重组菌体并分离水溶性组分作为粗酶,以褐藻酸钠为底物进行酶解反应,在235 nm测定产物的吸收值.结果该基因片段300 bp大小,GenBank收录号为AY736133,所编码的氨基酸序列中含有基序“NNHSYW”,且在系统发育树中与假单胞菌的AlgL聚类.在优化条件下获得粗酶,酶解反应产物在235 nm有显著吸收,表明重组融合蛋白具有褐藻胶裂合酶活性.褐藻胶裂合酶的研究较多,但其活性片段的重组表达研究少见报导.     

多重PCR筛选临床细菌耐药整合子基因

目的：建立多重PCR方法并对临床菌株进行扩增及整合子分类。方法：采用多重PCR对21株来自临床的耐药菌株进行了第一、二和三类整合酶基因（int Ⅰ）筛选。结果：16株携带第一类整合酶基因;1株携带第一和第二类整合酶基因;2株含第二类整合酶基因;1株含第三类整合酶基因;1株不含第一、二和三类整合酶基因。结论：筛选细菌耐药整合子基因分类的多重PCR方法简便可靠;整合子广泛存在于临床耐药细菌中。     

铜绿假单胞菌耐药机理

铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌．本文从生物被膜、细胞密度依赖式毒力因子、外排系统、基因盒一整合子系统及铜绿假单胞菌噬菌体几方面对其耐药性机理进行了概述，并提出了未来对微生物耐药性研究和应用的一些策略。     

铜绿假单胞菌的耐药现状及外膜孔蛋白分析

目的:总结分析我院2007年-2009年铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药状况,以指导临床合理选用抗生素,同时探讨外膜孔蛋白缺失介导的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制.方法:采用PCR方法检测外膜孔蛋白OprD的编码基因,利用Whonet 5.4 软件对药敏资料进行统计分析.结果:3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为13...     

牙鲆迟钝爱德华氏菌的分离及其鉴定

从患腹水病牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定;根据GenBank上报道的迟钝爱德华氏菌标准株(ATCC15947)的16S rDNA序列以及致病性迟钝爱德华氏菌所含有的菌毛亚基(Fi mA)基因(AB100170)的核苷酸序列设计了2对引物,对所分离到的6株疑似菌进行PCR扩增,均能够扩增出目的条带,基因片段大小分别为1 399,540 bp.序列分析表明,扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源,同源性分别为98.86%,100%.分子生物学鉴定结果与常规细菌鉴定方法所得结果一致,证明该菌为迟钝爱德华氏菌.将该菌肌肉注射鲫鱼,发病症状与自然死亡的症状相似,并从患病鲫鱼体内分离到该菌,说明所分离的迟钝爱德华氏菌是患病牙鲆的原发病原菌.     

烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌的分离及耐药性分析

目的 了解烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药谱的变化,为防治烧伤病区患者感染铜绿假单胞菌提供合理用药依据.方法 常规方法收集同一时间烧伤病房9名感染患者的患部浓汁和血液标本,分离鉴定出9株铜绿假单胞菌,K-B法进行药敏试验及统计学分析.结果 9株铜绿假单胞菌对氨苄西林、哌拉西林、亚胺培南/西司他丁、头孢他啶、氨曲南、阿米卡星、复方磺胺等11种抗菌药物耐药率均为100%.结论 烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药现象严重,应注意铜绿假单胞菌耐药性的监测.     

食源蜡样芽孢杆菌16SrDNA分子鉴定及其抑菌活性的研究

对食源中筛选的具有抑菌活性、初步鉴定为蜡样芽孢杆菌的4株菌,进行16SrDNA分子鉴定,采用PCR扩增技术,建立4株菌的系统发育进化树,进行序列同源性分析,并通过琼脂打孔扩散法测定4株菌发酵液的抑菌谱.实验结果表明,4株菌16SrDNA基因序列基本一致,为同源蜡样芽孢杆菌,命名为BC2345.4株菌的发酵液具有较宽的抑菌谱,对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌等常见病原菌具有抑制作用.     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的apoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3.5K,重组的pPIC3.5K apoAⅠ用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子,再通过PCR鉴定证实apoAⅠ基因已整合到染色体上.其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,收集细胞裂解后,用SDS PAGE与Westernblotting检测,证明胞内有明显的rApoAⅠ表达,其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同.     

萘和苯酚降解菌中儿茶酚2，3-双加氧酶基因的类似性分析及杂种酶构建

从7个萘降解菌株和5个苯酚降解菌株中经PcR扩增得到12个儿茶酚2,3-双加氧酶(C23O)基因,大小均为924 bp.根据DNA序列的类似性,可将这12个C23O基因聚类为3组,此结果与分离菌株的样本来源基本一致.这12个基因均编码307个氨基酸残基的儿茶酚2,3-双加氧酶,序列中都含有9个严格保守的氨基酸残基(Gly30、His153、Leu172、His199、His214、His246、Tyr255、Pro259、Glu265),均属于外切双加氧酶的I.2.A亚家族.通过盒式PCR,用各种萘和苯酚降解菌的C23O基因中心区替换恶臭假单胞菌ND6菌株pND6-1质粒中nahH基因的中心区,得到5个杂种C23O基因,这些基因在pET-E.coli BL21(DE3)系统中表达以后,均能检测到C23O活性,其中中心区来自假单胞菌ND24菌株C23O基因的杂种酶C23O-ND24,其比活力高于对照恶臭假单胞菌ND6菌株的野生型C23O.     

三株弧菌热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

 根据GenBank中同类蛋白序列设计特异PCR引物,从2株创伤弧菌Vibrio vulnificus和1株河弧菌Vibrio fluvialis中扩增出热休克蛋 白70（heat shock protein, hsp70）基因片段。对这3个片段进行克隆、测序和分析的结果表明,3个片段长均为1 911 bp,包含完整的 hsp70 ORF,编码636个氨基酸。它们的氨基酸序列与GenBank中其它物种hsp70的氨基酸序列比较发现,2株创伤弧菌hsp70基因序列 和同种其它菌株的同源性高,达98%以上;而河弧菌的hsp70序列属首次克隆;与多种原核和真核生物的hsp70氨基酸序列一起构建 了系统进化树,结果支持传统的分类结果。     

肾移植术后感染致病菌的整合子分类及耐药分析

目的:探讨肾移植患者病原菌的整合子基因分类与耐药的相关性,以期控制和预防院内感染,合理使用抗生素。方法:收集我院19例肾移植患者的19株细菌培养结果和药敏试验的资料,用多重PCR方法进行病原菌整合子的基因检测,并用K-B法与M IC法对其进行药敏分析。结果:①19株致病菌在体外药敏实验中都对抗生素产生严重的多重耐药。②产整合酶基因的菌株共12株,占63%;其中革兰阳性球菌3株,占25%;革兰阴性杆菌9株,占75%;其中2株为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCON),4株为产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的大肠杆菌,1株为产ESBL的肺炎克雷伯菌,其余为肠球菌1株、肠杆菌3株和洋葱伯克霍尔德菌1株。③产整合酶均为Ⅰ类整合酶,其中检测出耐药基因盒为1 009 bp的5株,1 664 bp 1株。结论:肾移植患者的病原菌都存在严重的多重耐药性并与整合酶基因有密切相关。对肾移植患者病原菌进行整合酶基因与药敏分析是控制和预防病区交叉感染、合理使用抗生素治疗多重耐药细菌,降低病死率的关键因素。