聚乙二醇6000沉淀法提纯线粒体DNA

本文介绍一种纯化线粒体 DNA的新方法。提取线粒体总核酸后,采用 NaCl盐析法,将线粒体大分子RNA与线粒体DNA分开,得到线粒体DNA 粗制品。再用聚乙二醇6000沉淀法进行纯化,从而得到纯的线粒体DNA。 此方法与 Sepharose 4B柱层析及氯化铯—溴化乙锭密度梯度超速离心纯化线粒体DNA的方法比较,具有经济、简便的特点,同时还可分别得到大分子线粒体RNA及小分子线粒体RNA。用此法制备的线粒体DNA易于酶切。     

氧化亚铁硫杆菌Tf-55基因文库的构建

以λEMBL_3噬菌体 DNA作为载体,用BamHI/EcoRI双酶切后,与Sau3AI部分酶切的氧化亚铁硫杆菌Tf-55染色体10～23Kb DNA片段连接,体外包装成重组噬菌体,所得重组子为6×10~4Pfu(噬菌斑形成单位)达到了建库要求的理论值。并用酶切分析及分子杂交的方法对该库进行了验证。     

北京鸭核DNA中β-珠蛋白基因的初步鉴定

以鸡β-珠蛋白基因为探针、用Southern blot杂交方法和蔗糖密度梯度超速离心——点膜杂交的方法、鉴定出北京鸭β-珠蛋白基因位于核DNA的EcoRI限制性内切酶酶切片段中大小约为20～23kb部分。     

褐飞虱取食水稻幼苗cDNA文库的构建及筛选

以褐飞虱取食 3 2 h的水稻幼苗为材料构建了 c DNA文库 ,初始文库含 3 .2× 1 0 6 个克隆 ,重组率为 86%,取 1 .0× 1 0 6个克隆子扩增一次 ,收集到 80 m L滴度为 1 .2× 1 0 9pfu/ m L的扩增文库 .随机挑取 2 0个克隆以 T7和 M1 3 reverse为引物进行 PCR扩增 ,以鉴定插入片段的大小 ,结果发现多数片段的长度在 1～ 4.0Kb左右 ,少数片段在 4Kb以上 ,个别片段在 6Kb左右 .以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的 ESTBp Hi0 0 8为探针 ,筛选 c DNA文库 ,得到该基因的 c DNA全长     

与小麦高分子量谷蛋白基因探针杂交的阳性克隆分离及基因在重组子上的定位

将经San 3A部分酶切后的小麦总DNA片段克隆到λCharon40载体上构建了小麦基因文库.以两个人工合成的同源于小麦高分子量(HMW)谷蛋白基因的片段对此基因库进行筛选,获得了两个阳性克隆,推测其中一个包含了HMW谷蛋白全部的基因顺序.两个克隆的部分限制性内切酶位点已被确定.在Southern杂交中,用位于基因编码区内的寡核苷酸片段作探针,将阳性部分定位在一定的酶切片段上.     

大鼠20αHSD基因调控序列的克隆与检测

酶切包含20αHSD基因及其调控序列的X噬菌体13NA,获得4．0kb的DNA大片段,将此片段与载体质粒连接得到重组质粒,酶切重组质粒后电泳,再以地高辛标记的20αHSD基因的cDNA为探针进行Southern杂交,实验获得了大片段的重组质粒。     

α—地中海贫血患者的α—珠蛋白基因组织的分析

α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因全部和部分缺失所致的一种遗传性溶血性贫血综合征。本文从重组质粒pHα_2中提取和纯化α_2片段(1.6kb),以α-~(32)p-dCTP标记做珠蛋白基因探针对Hb-H病人和Hb-Bart水肿综合征的血细胞DNA进行限制性内切酶谱分析。用HindⅢ和BglⅡ酶解Hb-H病人的非缺失型分别得16.4、4.5和3.8Kb三个特异片段和12.5、7.5二个片段。而Hb-H缺失型病人分别得到16.4、4.5和7.5或16Kb特异的α-基因片段。酶解Hb-Bart胎儿血DNA则没有α-基因特异片段。     

茶毛虫核型多角体病毒DNA性质的研究

本文报道了对茶毛虫核型多角体病毒蒙山株系(EpNPV-M)核酸性质研究的结果。EpNPV-M含双链DNA分子,含量为6.85μgDNA/mgPIB,提纯的DNA具典型的紫外线吸收特性,琼脂糖凝胶电泳证明DNA分子是大小均一的。DNA的(G+C)％为36.6,限制性片段积加法测得该DNA分子量为75.61×10~6道尔顿,109.57Kb,电镜法测得DNA分子长度为35.8μm,相当于分子量为74.1×10~6道尔顿,107.4Kb.电镜观察证实该病毒含有一些超螺旋环状DNA分子。建立了三种限制性内切酶对该DNA的酶切图谱。三种酶的酶解片断数为:EcoRI,27个;BglⅡ,15个;BamHI,9个。     

一种新细胞因子基因真核表达载体的构建和鉴定

采用PCR方法,以人胎盘cDNA文库为模板,扩增出人B淋巴细胞刺激因子（hBLys）,经克隆测序及纯化后,再以此PCR产物为模板,用Nest-PCR方法进一步扩增得到B淋巴细胞刺激因子的胞膜外功能区域（hsBLyS）的DNA片段,纯化、克隆测定鉴定后,扩增并纯化粒,经酶切、纯化后克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）中,构成真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hsBLyS。结果表明：用此方法制备得到的hsBLyS的DNA片段经测序鉴定与文献报道相符,构建的真核表达载体经鉴定也达到了预计的结果。     

污水处理系统中噬菌体的浓缩分离和宏合格基因组DNA的提取

以城市污水活性污泥为材料,经分级粗滤、超滤、等密度梯度离心等方法获得高纯度噬菌体悬液,常规SDS方法提取噬菌体DNA.荧光显微镜观察和计数表明浓缩液中噬菌体的纯度和丰度都显著提高;利用透射电镜对浓缩液进行观察,噬菌体的形态呈杆状、线状等多样;基因组提取结果显示,得到的DNA样品纯度高,大小介于20~25kb之间,电泳条带清晰,整个泳道没有弥散现象;利用细菌通用引物对提取的噬菌体DNA进行16SrDNA扩增阴性,说明所得到的噬菌体纯度较高,没有细菌污染.通过实验获得一种高效快捷的从污水处理系统中纯化浓缩噬菌体并进一步获得噬菌体宏基因组DNA的方法,同时为研究环境噬菌体生态分布、多样性组成奠定基础.     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建与鉴定

利用λZAPExpress载体成功地构建了中国猪株旋毛虫分离株Trichinellaspiralis新生幼虫的cDNA文库 ,并对其重组噬菌体质粒pBK—CMV进行酶切鉴定 .结果表明 :所构建的cDNA文库容量为 1 92× 10 6,重组效率为 98 6 % ,所有的克隆片段都在 0 5— 2 0Kb之间 ,说明此cDNA文库几乎覆盖了全部mRNA .     

HL—60细胞系基因组文库的构建

从培养的HL-60细胞中提取出高分子量的基因组DNA,以EcoRⅠ部分酶解,蔗糖密度梯度离心得到15～30kb的插入片段。以PEG8000沉淀,CsCl密度梯度离心提纯EMBL4噬菌体DNA,以EcoRⅠ,EamHⅠ双酶解得到左右臂,连接、包装得到9.7×10~5个重组体.随机检测了4个重组体,其插入片段平均为19kb.对于19kb的插入段,特定DNA序列达到99％检出率所需的重组体为7.3×10~5(Pfu).     

一种直接用于PCR分析的风沙土微生物总DNA提取方法

以风沙土为材料,直接提取土壤微生物DNA.采用SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融法裂解细胞得到DNA粗提液,以PEG对其纯化.结果表明,SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融法裂解细胞可获得大片段的DNA,提高DNA产率.每克干土的DNA提取量为0.586～1.311μg.所提DNA片段在23Kb以上.PEG可有助于去除DNA中腐植酸,DNA不作回收纯化即可作为模板进行16SrDNAPCR扩增.SDS—溶菌酶—CTAB—蛋白酶K和液氮反复冻融裂解细胞、PEG纯化DNA的方法组合是一种简便的适合风沙土微生物总DNA的提取方法.     

巴西橡胶树基因组文库的构建

用改良 CTAB 法提取巴西橡胶树幼嫩叶片总 DNA,通过限制性内切酶 Sau3A 不完全酶切,回收并纯化后得到15～23 kb 的 DNA 片段。以来源于λ噬菌体的 EMBL3为载体 DNA,用T_4DNA 连接酶将载体与 DNA 片段连接成为重组 DNA。经体外包装形成完整的噬菌体颗粒,转染受体菌E.coli LE392,在 LB 平板培养基上获得重组子的效率为1.1×10~6个/μg DNA,达到构建文库的要求。随机挑取一定数量的克隆子,酶切分析结果发现有88%的克隆子携带外源 DNA。     

T7噬菌体文库构建中载体制备及连接条件的优化

目的分离纯化T7噬菌体DNA并构建T7select10-3b载体.方法用酚和氯仿:异戊醇(24:1)提取得到T7噬菌体DNA.用EcoRI和HindIII对T7DNA进行双酶切 ,得到载体的左臂和右臂.最后通过试剂盒从琼脂糖凝胶中回收载体的左右臂,用紫外分光光度计测定其纯度.与外援片段连接后进行体外包装.结果构建得到T7select10-3b载体 ,载体的左右臂大小分别为19kb和16kb,并成功包装成噬菌体颗粒.结论本方法适合大量提取纯化T7DNA和T7select10-3b载体,得到的载体可用于构建cDNA文库等其它基因工程的操作.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

一种制备高效价噬菌合格悬液的有效方法

介绍了一种制备高效价噬菌体悬液的方法,并将其产量和效价与传统方法所得结果进行了比较,结果证明该方法所得噬菌体悬液的效价和产量最高。     

不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核DNA的多态性比较

对草丛土毛虫（Territricha stramenticola）营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA进行了RAPD比较分析．在所选用的32条随机引物中,2条没有扩增带,其余30条引物一共扩增出134条片段,以营养细胞大核DNA为模板扩增出54条片段,以休眠包囊大核DNA为模板扩增出80条片段,两者有20条共享片段,共享度为30％．结果表明：草丛土毛虫在形成包囊的过程中,大核DNA的结构可能发生了较大的变化,这些变化可能与其在包囊形成过程中的形态结构和代谢活动的改变以及休眠状态下生理活动的改变密切相关．     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。