海南岛5例HbH病α-珠蛋白基因分析

本文报告采用限制性内切酶和(?)—、(?)—珠蛋白基因探针杂交分析技术,分析海南岛五例HbH病人的(?)—珠蛋白基因结构。结果证明4例属于非缺失型与(?)—地贫1双重杂合子,1例为左侧缺失型(?)—地贫2与(?)—地贫1双重杂合子。     

红系特异表达载体在转基因小鼠中表达的研究

为在个体水平上研究珠蛋白基因位点控制区的HS2,HS3及HS2-HS3元件对β-珠蛋白基因的时空表达调控作用,选择本实验室构建的CMV/GFP,HS2ALL,HS3ALL,HS23ALL等4种重组载体,经限制性酶切及两步纯化,得到了5种重组DNA片段:CMV/GFP,HS2/GFP,CMV/HS2/GFP,HS23/GFP,HS3/GFP,并用显微注射技术获得转基因小鼠.用流式细胞仪分析转基因各组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,结果表明HS2元件及1.7kb的β-珠蛋白启动子足以调控β-珠蛋白基因的组织特异性表达.此外,在不同的转基因小鼠中,GFP的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,HS2与HS3元件在调控β-珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且两者显示出显著的协同作用.     

Gene analysis of 400 cases of thalassemia

目的:应用基因诊断技术对400例病人进行地中海贫血(简称地贫)基因检测,了解其基因突变的类型,旨在为临床预防地贫重症患儿的出生提供指导.方法:400个样本分别检测α-地贫及β-地贫基因型,α-地贫采用gap - PCR技术检测东南亚型缺失(--SEA)、右侧缺失(-a3.7)和左侧缺失(-a4.2),β-地贫采用聚合酶链反应(PCR) -膜反向点杂交技术(RDB)检测β-珠蛋白基因上的17个位点突变.结果:在进行地贫基因检查的400例病人中,检出α-珠蛋白基因缺失的有118例,检出β-珠蛋白基因突变者共78例,均为杂合子,检出αβ复合型地贫者6例,检出Barts水肿胎儿1例.结论:基因诊断技术能确诊地贫缺失或突变,检测绒毛、羊水或脐带血时须避免母体血污染.     

用α—珠蛋白基因探针对两例Hb—Bart''''s胎儿双亲的α—基因的探测

采用限制性内切酶印迹杂交放射性自显影技术和α—珠蛋白基因探针分析了二例Hb—Bart's胎儿水肿综合征及其双亲的α—珠蛋白基因,其分析结果表明:Hb—Bart's胎儿水肿综合征没有α—基因;其双亲则以内切酶HindⅢ消化其DNA得到17、4.5、3.8kb α—基因特异片段,用内切酶Bgl Ⅱ消化则得12.3、7.2kb二个α—基因特异片段。其基因图谱与正常人相似,为正常人的一半。     

白蚁头部纤维素酶基因的克隆与表达

对中国广泛分布的黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)头部内切β-1,4葡聚糖酶(endo-beta-1,4-glucanase)基因进行克隆,并在原核生物大肠杆菌体内进行了表达.根据Genbank上已报道的endo-beta-1,4-glu-canase基因设计引物,通过RT-PCR获得1个完整的内切β-1,4葡聚糖酶基因.通过基因测序以及基因比对发现与Genbank上发表的内切β-1,4葡聚糖酶同源性高达96.40%.将获得的基因导入大肠杆菌体内进行诱导表达,表达出的蛋白经Western-blot检测,为该基因所表达的目的蛋白.实验为进一步对内切β-1,4葡聚糖酶的实际应用奠定一定的实验基础.     

应用聚合酶链反应与斑点印迹杂交产前诊断β地中海贫血

应用聚合酶链反应(PCR)体外基因放大,~(35)S 标记β-珠蛋白基因探针与 DNA分子杂交斑点印迹新方法,对携带者进行了基因分析,对胎儿进行了产前诊断检测。对3对夫妇的检验显示,他们分别是41-42,-28或17突变基因携带者,2例胎儿正常,1例为杂合子。     

腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β-珠蛋白基因在红系细胞中整合与表达

为提高人β-珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平,构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β-珠蛋白基因腺相关病毒ade-no-associatde vits,AAV)载体AV531E2Δβ2Neo和AV53HS432Δβ2pNeo．利用AAV载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞(MEL),分析了它们在MEL细胞中的整合与表达．结果表明,AAV载体介导带多个基因座控制区核心序列的人β-口珠蛋白基因在MEL细胞中较稳定整合,呈现与内源α-珠蛋白基因可比的表达水平．     

α—地中海贫血患者的α—珠蛋白基因组织的分析

α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因全部和部分缺失所致的一种遗传性溶血性贫血综合征。本文从重组质粒pHα_2中提取和纯化α_2片段(1.6kb),以α-~(32)p-dCTP标记做珠蛋白基因探针对Hb-H病人和Hb-Bart水肿综合征的血细胞DNA进行限制性内切酶谱分析。用HindⅢ和BglⅡ酶解Hb-H病人的非缺失型分别得16.4、4.5和3.8Kb三个特异片段和12.5、7.5二个片段。而Hb-H缺失型病人分别得到16.4、4.5和7.5或16Kb特异的α-基因片段。酶解Hb-Bart胎儿血DNA则没有α-基因特异片段。     

巨大芽孢杆菌AP25内切葡聚糖酶基因的克隆及序列测定

从土壤中分离到一株产纤维素酶的巨大芽孢杆菌AP25,经羧甲基纤维素平板检测,该菌可产生葡聚糖内切酶。根据GenBank登录的β-1,4内切葡聚糖酶基因（DQ782954．1,M28332．1,AY859492．1）的同源性序列,利用PCR方法克隆到该酶的基因,并对其进行测序。测序结果显示其全长为1500bp,推测其含499个氨基酸。与GenBank中的已知葡聚糖内切酶相比较,发现该酶的氨基酸序列与Bacillus subtilis的β-1,4内切葡聚糖酶基因同源性达到达94％。     

内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究进展

纤维素酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,它在能源、纺织、饲料、食品和造纸等行业具有重要的应用。对内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌、酵母和丝状真菌中的克隆和表达进行概述,为内切葡聚糖酶基因工程菌的构建和内切葡聚糖酶的应用提供理论依据。     

克隆含有MT-Ⅰ和MT-Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠MT-ⅠcDNA作为探针,从129小鼠的基因组库中获得含MT-Ⅰ基因的DNA片段。从6.8×10⁵的噬菌斑中挑出4个阳性噬菌体克隆,分别命名为1-1, 2-1, 1-6和4-3。在这4个克隆中1-1和2-1的阳性信号更强些。应用插入片段的末端引物作为探针进行杂交结合部分酶切的方法,对这2个克隆的插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,确定了克隆1-1和2-1的酶切图谱及MT-Ⅰ基因在2个克隆DNA中的位置。并进一步发现和证明了在2个克隆中含有MT-Ⅱ基因。     

嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

首先通过引物设计扩增嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,然后采用Not I和Xho I双酶切目的基因与载体pPICZα-A,通过T4连接酶连接后转化DH5α菌株,挑取阳性克隆进行测序,测序正确阳性克隆放大培养,大量提取质粒,并采用限制性内切酶Sac I线性化质粒,电转化感受态酵母细胞,经培养后挑选转化子分别对应点种到MM、MD平板,并利用ZeocinTM获得多拷贝重组子,最后经甲醇诱导,并于48、54 h取样,经SDS-PAGE分析,结果表明整合嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶的毕赤酶母工程菌株构建成功.     

海南岛两个HbH家系α-珠蛋白基因型分析

∝-地中海贫血病在我国海南岛也是一种较为常见的遗传性疾病。本文报道应用∝-珠蛋白基因探针以及限制性内切酶图谱印迹杂交技术分析海南岛两个HbH家系(汉族)的∝-珠蛋白基因型。其中家系一(一家共六人:父、母、大姐姐、二哥哥、三哥哥及先证者林某)的∝-珠蛋白基因型分别为:先证者林某是非缺夫型与∝-地贫_1双重杂合子(∝∝~T/--)、父亲是∝-地贫_1杂合子(∝∝/--)、母亲是非缺失型杂合子(∝∝~T/∝∝)、大姐姐是∝-地贫_1杂合子(∝∝/--)、两位哥哥是正常∝-珠蛋白基因型或非缺失型杂合子(∝∝/∝∝)或(∝∝~T/∝∝);家系二(一家共四人:父、母、哥哥及先证者范某某)的∝-珠蛋白基因型分别为:先证者范某某是∝地贫_1与∝-地贫-1双重杂合子(-∝/--)、父亲是∝-地贫_1杂合子(∝∝/--),母亲是∝-地贫_2杂合子(-∝/∝∝),哥哥是正常∝珠蛋白基因型(∝∝/∝∝)。     

生物素标记核酸探针杂交检测灵敏度的比较研究

用Biotin-11-dUTP进行缺口翻译缺备生物素标记的人β-珠蛋白基因探针并用该探针进行了斑点杂交，硝酸纤维素膜印迹杂交 及琼脂糖凝胶直接染交方法学比较，结果表明：经ABAP法显色后，上述三种杂交法中，DNA最低可检测量依次为5，10，50pg，以斑点杂交法最灵敏。     

灵芝菌液态发酵富硒大豆过程中酶活性的研究

以富硒大豆豆乳为培养基,接种灵芝菌种进行发酵,对发酵过程中的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力变化趋势进行研究.结果表明,在0～132 h范围内,酸性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力呈增加趋势,发酵至132 h,酸性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力达最大值,分别为9.87、0.87、0.951、.07、1.85 U/mL,中性蛋白酶活力在发酵108 h达最大值5.35 U/mL.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp．NW-2004a，并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库，且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆．对其中一阳性克隆中插入的DNA片段（命名为GLUD）进行序列测定，发现了一长度为2502bp的开放阅读框（ORF），可编码834个氨基酸．BLAST分析结果表明，该基因与Bacillus sp．KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86％相似性，所编码的多肽与Bacillus sp．KSM-64来源的β—1，4-内切葡聚糖酶具89％的相似性，故该基因是一新发现的β—1，4-内切葡聚糖酶基因．该序列已收录于Genebank，登录号AY663839．另外，以cpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1，4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625Glu，最后通过平板检测及SDS—PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达．     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实

【目的】为了解决纤维素的酶水解问题,分析能水解纤维素的微生物的相关基因。【方法】从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的基因组数据中挖掘纤维素酶相关基因,发现开放读码框Cel8A和纤维素酶基因序列具有高相似性。利用重组表达技术在大肠杆菌中对Cel8A基因进行表达,纯化重组蛋白质并对该蛋白质进行功能鉴定。【结果】Cel8A蛋白质能水解羧甲基纤维素钠,它具有β-1,4-内切葡聚糖酶的水解特性。Cel8A的最适反应pH值为7.0,最适温度为40℃。【结论】成功克隆表达阴沟肠杆菌的Cel8A基因,并证实该基因编码的蛋白质具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性,为进一步研究阴沟肠杆菌的纤维素酶组成以及纤维素降解机理奠定了基础。     

纤维素降解菌N2-10菌株β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

为探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2-10菌株降解纤维素的机理,通过同源性比对设计兼并引物扩增菌株β-1,4-内切酶葡聚糖基因,并进行生物信息学分析,然后研究其在大肠杆菌中的表达情况.结果显示,该内切葡聚糖酶基因大小为1500bp,共编码499个氨基酸,具有典型的纤维素酶结构,SDSPAGE电泳检测其表观分子质量约为55ku;刚果红染色显示,表达产物具有纤维素酶活性.     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。