上海市11种常规粳稻抗稻瘟病基因分子标记检测

利用分子标记检测技术,对9种参加2020年上海市水稻区域试验的品种和2种本课题组新培育的新品系的共10个抗稻瘟病基因位点进行了检测.结果显示,Pi37,Pi41,Pi-d23个基因在11种水稻中出现的频率达100％,Pi2,Pi5,Pi9,Pi36,Pikm和Pib抗性基因在11种水稻中出现的频率分别为18.18％,9...     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

水稻淀粉合成酶基因来源与稻米蒸煮和食味品质的相关性分析

为研究水稻淀粉合成酶基因对稻米蒸煮和食味品质性状的影响,利用根据籼粳基因组序列差异设计的Wx、SssⅠ、SssⅡa基因的分子标记检测来自“南京11”和“Balilla”的DH群体共130个株系,结果表明,Wx基因位点决定AAC的变异,并在控制GC变异时起主要作用;SssⅡa基因位点是决定GT变异的主要因素。3个基因位点的分子标记可为稻米蒸煮和食味品质的筛选和改良提供便捷的工具。     

利用CRISPR /Cas9技术快速创制香型“秀水134”水稻

以目前上海市主栽的高产常规水稻"秀水134"为材料,利用CRISPR/Cas9技术成功敲除甜菜碱醛脱氢酶2基因,获得了两种类型纯合突变体植株.采用表达载体特异性结合的引物检测T_1代转基因植株,成功获得6株不携带载体骨架的转基因植株.定量PCR分析显示,突变体植株甜菜碱醛脱氢酶2基因表达量极显著低于野生型对照(p0.01),但突变体植株成熟种子香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)含量极显著高于野生型对照(p0.01).比较野生型对照与突变体植株的主要农艺性状和产量性状,两者间都没有显著差异(p0.05).本研究可为加快高产香型水稻在上海及周边地区的推广应用,以及为今后利用CRISPR/Cas9技术快速培育其他高产香型水稻新品种研究奠定基础.     

水稻OsDDB2基因过量表达载体的构建及其转化

利用农杆菌介导法将构建好的水稻OsDDB2过表达载体导入水稻,共获得植株4株,经PCR检测确定4株皆为转基因植株.田间性状分析发现转基因植株的结实率(平均6.05%)远远低于野生型植株的结实率(平均87.4%).相应地,花粉粒I_2-KI染色结果显示转基因植株的花粉数远少于野生型植株的花粉数.这些初步实验结果为进一步研究水稻DDB2基因的功能奠定了基础.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

控制水稻红米性状相关基因分子标记的开发

红米因其独特的营养价值日益受到人们关注.红米由两对非同源染色体上的Rc、Rd显性基因控制,且Rc、Rd基因同时存在时,水稻才表现为红米表型.本研究分别在Rc和rc等位基因以及Rd和rd等位基因影响性状的关键性位点上建立了分子标记:Rc(+5150)和Rd(+276).检测结果显示:这2个分子标记可以分别用来区别控制红米性状的Rc/rc和Rd/rd基因型.开展本研究,为今后利用分子标记辅助快速有效地选育各类红米水稻新品种研究提供了重要的帮助.     

利用TRV过表达和沉默系统验证植物油脂合成相关基因的功能

为探究烟草脆裂病毒过表达和沉默系统进行油脂相关基因研究的可能性,该研究克隆了拟南芥的WRI1和FAD2基因,分别构建了TRV过表达和沉默载体. 利用瞬时侵染技术侵染本氏烟草,取材料进行RT-PCR和脂肪酸含量检测. 结果显示在过表达WRI1基因的本氏烟草中,侵染叶和非侵染叶的WRI1基因及其相关参与脂肪酸合成基因ACP1、KAS1和BCCP2等都有明显上调,且脂肪酸含量检测结果显示分别增加16%和28%. 在沉默FDA2基因的本氏烟草植株中,发现多不饱和脂肪酸含量分别减少约25%和24%. 因此,利用TRV系统对油脂相关基因进行研究是可能的.     

第二大类CRISPR-Cas系统在肿瘤研究的应用

第二大类CRISPR-Cas系统具备多重基因编辑修饰功能,仅由单效应蛋白介导完成干扰过程,包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统,及识别并切割单链RNA的Cas13系统.综合介绍第二大类CRISPR-Cas系统的结构与功能基础、作用机制,及其在构建肿瘤模型、肿瘤免疫治疗、耐药性研究、核酸检测等方面的应用,为进一步开发CRISPR-Cas工具并应用于临床医学研究提供参考.     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除新型胚胎干细胞系

胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转染嘌呤霉素(puromycin)标记的PX459-sgRNA载体,使用CRISPR-Cas9技术分别构建Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除的胚胎干细胞系,通过基因型鉴定、PCR产物测序、qPCR和Western Blot等实验得到Bdh2、Dnmt3a和Dusp9纯合缺失的胚胎干细胞系.之后,qPCR、免疫荧光染色分别检测了Bdh2、Dnmt3a和Dusp9缺失的胚胎干细胞中多能基因、DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因表达变化.另外,通过嵌合体制备方法检测Dusp9基因敲除对胎儿卵黄囊(yolk sac)和胎盘(placenta)等发育的影响.实验结果表明,KO细胞系中分别敲除的基因(Bdh2、Dnmt3a和Dusp9)在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(p0.05),且不同程度地影响了DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因的表达.Dusp9KO嵌合体结果显示,Dusp9KO均能贡献到胎儿及卵黄囊,但是,能否贡献到胎盘尚待进一步深入探究.本研究成功获得纯合敲除Bdh2、Dnmt3a和Dusp9基因的胚胎干细胞系,为研究Bdh2、Dnmt3a和Dusp9三种基因在胚胎干细胞中的作用提供了重要依据.     

G9a对TMS1基因表观调控作用的研究

为探究组蛋白H3K9me2催化酶G9a对甲基化诱导静止基因1(Target of Methylation induced gene Silencing 1, TMS1)的表观调控作用, 通过染色质免疫共沉淀实验检测G9a在TMS1基因启动子区域的结合情况, 然后构建shRNA表达载体转入细胞敲低G9a, 检测TMS1启动子区域组蛋白H3K9me2修饰程度与TMS1 mRNA表达水平.研究结果显示G9a在TMS1基因启动子区域有结合, 敲低G9a后, TMS1基因启动子区域H3K9me2抑制性修饰程度降低, TMS1 mRNA表达水平上升.此结果表明G9a可能通过在TMS1基因启动子区域产生H3K9me2抑制性修饰的方式参与了TMS1基因的表观调控.     

利用RNAi沉默技术对水稻OsHAD1基因的功能分析

生物信息学分析推测了水稻OsHAD1基因属于HAD(haloacid dehalogenase)超级家族水解酶.为研究其功能,本实验设计构建了OsHAD1-RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻,成功获得了转基因植株.结果表明,转基因植株与野生型(日本晴)相比,转基因植株从T0代到T2代结实率均有20%～50%的降低;实时荧光定量PCR分析显示,T2代独立转基因植株中OsHAD1基因的表达量均有50%以上的下调;花粉染色结果显示,转基因植株花粉染色异常,败育率高,平均败育率达71.19%;石蜡切片结果显示,转基因植株花粉形状不规则,在花粉囊中排列松散,并且植株表现出明显的雄性不育.因此,推测OsHAD1基因参与水稻的生殖发育.     

miR-34a靶向调控前列腺癌发生相关基因SIRT1的表达

前列腺癌在我国发达地区发病率迅速升高,化疗耐药是前列腺癌治疗最棘手的阶段,因此基于小RNA的无免疫原性的治疗具有广泛应用前景。研究表明miR-34a具有抑癌作用,而其靶标基因的鉴定鲜有报道。本研究结果显示SIRT1基因的表达存在着转录后基因表达调控机制。miRBase数据库预测显示SIRT1基因3’-UTR序列中存在着19个miRNA的靶标位点。通过系列截断实验及萤光素酶报告系统来鉴定到SIRT1基因3’-UTR区域中的功能miRNA为miR-34a。通过靶标位点的突变及三联体、miRNA的类似物及抑制剂来进一步验证了靶位点的有效性。在前列腺癌细胞DU145和CWR22RV1中存在miR-34a对靶标SIRT1基因的转录后抑制作用。本研究的结果可能为前列腺癌的miR-34a靶向基因治疗提供了理论依据。     

利用分子标记分析22种上海市重要水稻10个食味品质相关基因的基因型

稻米食味品质改良是目前水稻育种的重要研究方向之一.明确不同水稻食味品质基因型,可为优质水稻育种研究的亲本选择提供依据.本研究利用分子标记检测技术,对22个目前上海市种植的重要常规水稻和杂交稻亲本食味品质基因的基因型进行检测.结果发现,"紫香糯861"水稻含有相对较多不良食味品质基因型.3种杂交稻父本,"湘晴"、"R44"和"繁14"的食味品质基因型比这3种杂交稻母本,"寒风A"、"秋风A"和"申9A"以及其他常规稻有欠缺.从蜡质基因多态性分析显示,在本研究选用的22种水稻中,2个为糯稻、20个为粳稻,但其中有4个为软米型粳稻;在16个非软米型粳稻中,"宝农34"、"金丰"和"银香18"是具有相对最好食味品质基因型的水稻品种.     

水稻垩白性状的遗传研究进展

垩白性状是稻米最重要的品质性状之一,阐明水稻垩白性状的遗传机理十分重要.主要对水稻垩白的遗传基础、垩白数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)的定位及其垩白性状相关基因的分离与克隆进行了综述,并提出了相应的遗传改良措施,以期为优质水稻育种提供参考和借鉴.     

青海省育成小麦品种Ppo基因的分子检测

为全面了解青海省历年育成小麦品种籽粒中多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)活性的高低,本研究以82份青海省育成小麦品种为研究对象,利用PPO18,PPO16和PPO29这三个功能标记检测Ppo基因在Ppo-A1和Ppo-D1位点的等位变异和基因组成。结果表明:在Ppo-A1位点,有44份小麦含Ppo-A1a(高PPO活性)型等位基因,38份小麦含Ppo-A1b(低PPO活性)型等位基因。在Ppo-D1位点,42.7%的小麦含Ppo-D1a(低PPO活性)型等位基因,57.3%的小麦含Ppo-D1b(高PPO活性)型等位基因。在Ppo-A1和Ppo-D1 2个位点共检测到4种类型的组合:Ppo-A1a/Ppo-D1a,Ppo-A1a/Ppo-D1b(双高PPO活性),Ppo-A1b/Ppo-D1b,Ppo-A1b/Ppo-D1a(双低PPO活性),分布频率分别为24.4%,29.3%,28.0%和18.3%。两个基因组合类型中分布频率最低的是Ppo-A1b/Ppo-D1a(双低PPO活性),分布频率最高的是Ppo-A1a/Ppo-D1b(双高PPO活性)。     

尾细桉生长和木材密度关联SNP挖掘与候选基因定位

【目的】生长和木材基本密度是桉树的重要经济性状,挖掘其候选功能基因可为桉树遗传改良提供参考。【方法】以尾叶桉(Eucalyptus urophylla)和细叶桉(Eucalyptus tereticornis) F1全同胞子代试验林为研究对象,测定其8年生树高、胸径和木材基本密度,开展表型遗传分析。筛选极端表型个体,利用测序分型(GBS)开发SNP标记进行关联分析。挖掘与树高、胸径和木材基本密度关联的SNP位点,并进行候选基因初步定位。【结果】尾细桉F1子代树高、胸径与木材基本密度间的表型变异系数为7.51%~26.19%,生长性状与木材基本密度显著正相关。利用GBS获得了覆盖全基因组的15 185个SNP位点,关联分析共鉴定111个与生长和木材基本密度显著关联的SNP,其中2号染色体上检测到强烈的生长性状关联信号。定位40个与生长和木材基本密度相关候选基因,共富集在52个GO terms,基因功能注释分析表明其功能主要与植物抗逆性、生物与非生物胁迫、转录因子家族等相关。【结论】本研究获得了一批与尾细桉生长和材性性状关联的SNP位点和候选基因,并进行了树高、胸径及木材基本密度候选基因初步定位,挖掘的与抗逆性相关的基因可能在树木的生长和木材形成中发挥重要作用。     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

重要籼型杂交稻亲本“93-11”稻米食味品质的改良

以目前两系杂交稻大量应用的籼型水稻"93-11"和实验室已转化只含双份反义蜡质基因无抗性基因和报告基因纯合水稻"B3"为亲本,通过杂交和多次与"93-11"水稻回交以及分子标记辅助选择反义蜡质基因,将双份反义蜡质基因渗入到"93-11"水稻品种中,获得两种改良类型"93-11"水稻新材料.主要农艺性状考察、拷种以及糙米重量和体积分析显示,除了千粒重、糙米重量和体积,两种改良后水稻的株高、有效穗、每穗实粒数和结实率都与"93-11"对照水稻差异不显著(P0.05).两种改良后水稻蜡质糙米的直链淀粉含量(5.39%和5.01%)均比"93-11"对照(14.06%)极显著下降(P0.01);同时糙米胶稠度分别为93 mm和101 mm,与"93-11"对照(48 mm)比较也达到极显著差异水平(P0.01).研究为今后改良以"93-11"配组的两系杂交水稻食味品质奠定了重要基础.