家猪Ⅲ型干扰素的生物化学性质与抗病毒能力研究

根据(GenBank公布的家猪Ⅲ型干扰素序列,设计特异性引物,从猪肾细胞PK-15中调取了家猪干扰素PoIFN-λ1,-λ3的cDNA序列,构建成pcDNA3.1B-/PoIFN-λs真核表达载体,并进行表达及性质研究.首先检测了在中华仓鼠肾细胞(BHK-21)中的转录及翻译水平,发现PoIFN-λ1,-λ3分别具有1个及2个N端糖基化位点.其次,鉴定了PoIFN-λs在猪肾细胞IBRS-2及PK-15中对合成双链RNA poly I:C、口蹄疫病毒(FMDV)及伪狂犬病毒(PRV)的应答表达谱.此外,检测了PoIFN-λs在IBRS-2中诱导抗病毒基因及细胞因子的表达情况,结果显示PoIFN-λs可显著诱导MX、OAS、PKR等干扰素激活基因(ISGs)及细胞因子IL-6、TNF-α的表达.抗病毒实验表明,PoIFN-λs在PK-15/PRV及IBRS-2/FMDV系统均具有低于PoIFN-α12的抗病毒活性;但在与PoIFN-α12联合使用时,抗FMDDV效果增强,Real time PCR检测发现ISGs表达量协同升高.     

融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。     

基于肠道菌群分析探讨黄芪多糖调节高脂饮食小鼠血糖的可能机制

为探讨黄芪多糖在改善高脂饮食的小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平显著升高的作用机制及与肠道菌群的关系,选用30只C57小鼠,随机分为3组(n=10),分别为对照组(C,正常饮食)、模型组(M,高脂饮食)、黄芪多糖组(D,高脂饮食和20g/L浓度APS溶液)。喂养11周后收集空腹血液样品和粪便样本,利用基于细菌 16S rDNA 测序的元基因组学方法,分析APS 对高脂喂养小鼠肠道菌的影响；同时检测各组小鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)和血清炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平。结果发现高脂饮食使小鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平显著升高,明显改变了小鼠肠道菌群结构, IL-6和TNF-α水平也显著升高。而服用APS的高脂饮食的小鼠,空腹血糖和空腹胰岛素水平也显著下降,恢复了单纯高脂饮食引起的肠道菌群结构改变,IL-6和TNF-α水平也有所下降(但无统计学意义)。推测黄芪多糖显著降低小鼠血糖水平可能是通过改变高脂饮食小鼠肠道菌群结构及调节炎性因子IL-6和TNF-α水平而实现的。     

乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法的建立

目的建立乙型脑炎病毒(JEV)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选JEV敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BHK21细胞作为JEV敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-8.9.mL-1;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶2560;可检测到的病毒滴度最低为10-6.5.mL-1。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于猪及猪源性生物材料JEV的检测。     

黄芪多糖抗氧化作用的分子机制研究进展

通过大量的分子实验和体外实验研究,证明黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides,APS)具有广泛的药理作用和生物学活性.文章将从黄芪多糖抗氧化药理作用的NRF1、NRF2/ARE、P13K/Akt/eNOS、NF-kb、AMPK/PKC以及Caspase-3等信号通路方面作一综述,为其抗氧化作用的分子机制提供理论及实验依据.     

干扰素的基本特点与临床效果

干扰素(Interferon,IFN)是由细胞产生的一类诱生性蛋白质,研究发现干扰素具有广谱抗病毒、免疫调节及抗肿瘤三大功能,目前干扰素被公认为一种广谱治疗病毒性疾病的生物制剂,而且在抗肿瘤方面也呈现可观的临床疗效。早期干扰素是用病毒或干扰素诱生剂诱导人体细胞产生的自然干扰素,自然干扰素是含有不同型别及亚型的多种干扰素混合体(如人白细胞干扰素99％α-干扰素,1％-β干扰素)。近年来     

猪白细胞干扰素的制备及四种纯化方法的比较

本文以猪白细胞—鸭新城疫病毒Ⅱ系(NDVⅡ)为诱生系统探讨了猪白细胞干扰素(PLeIFN)诱生条件,并比较了四种方法纯化PLeIFN的效果。实验表明:(1)每毫升猪白细胞悬液加入40～80HA的NDVⅡ,产生PLeIFN效价>1500 u/ml;(2)猪白细胞经低浓度PLeIFN预处理可增强其产生PLeIFN能力,(3)PLeIFN预处理时间以3小时为宜;(4)猪白细胞干扰素在猪肾细胞上的抗病毒活性高于在鸡胚细胞上的活性;(5)四种方法中以硫氰酸钾—冷乙醇法纯化效果为好,该法去除杂蛋白能力高于其它方法;(6)用未酸化处理的PLeIFN粗制品可提高硫氰酸钾—冷乙醇法的纯化效果。     

黄芪多糖抗去势雌鼠骨质疏松的实验研究

目的:评价黄芪多糖预防大鼠卵巢切除后骨质疏松的药效学.方法:取8月龄雌性SD大鼠44只,随机分为4组,每组11只.黄芪多糖组(APS组)大鼠切除双侧卵巢后,黄芪多糖灌胃12周,与单纯卵巢切除组(OVX组)、假手术组(SHAM组)及尼尔雌醇灌胃组(E3组)比较.采用血尿生化检测、骨干/湿重、骨生物力学、骨密度测量和骨形态计量学等方法对黄芪多糖的药效学进行综合评价.结果:与SHAM组比较,OVX组骨干重、骨灰重、骨钙含量和骨密度、抗弯力、骨小梁体积密度及宽度均明显降低,而成骨细胞指数和破骨细胞指数、尿羟脯氨酸则明显增高.黄芪多糖及E3能使上述指标显著改善,接近正常水平.结论:黄芪多糖具有明显抗去势雌鼠骨质疏松作用.     

金银花枝叶抗猪蓝耳病毒有效活性部位化学成分的分离与鉴定

通过测定金银花枝叶提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的Marc-145细胞的最小保护浓度和对病毒感染滴度的影响来评价其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的活性.结果显示,金银花枝叶95%乙醇提取物经D101型大孔树脂吸附后,得到的60%乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞的最小保护浓度为6.25μg/mL,6.25μg/mL 60%乙醇/水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8 TCID50降低至100.3 TCID50左右,即60%乙醇/水洗脱部位具有良好的体外抗PRRSV活性.利用溶剂提取法、正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20和RP-HPLC等色谱法,从该有效活性部位中分离得到了5个化合物,通过理化性质和1 H NMR、13 C NMR等光谱数据鉴定化合物分别为Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4′-O-β-D-glucoside(1),Apigenin 5-O-β-D-glu-copyranoside(2),Secoxyloganin(3),Benzyl alcohol O-(6′-O-β-D-xylopyranosyl)-β-D-glucopyr-anoside(4)和Sweroside(5).     

α一干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的：探讨α-干扰素(α-IFN)、异搏定(VRP)对RCC-925肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法：(1)将RCC-925肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α-干扰素或异搏定或α-干扰素+异搏定及与不同浓度阿霉素(ADM)共同培养;MTT法检测肿瘤细胞的存活率。(2)图像分析仪检测逆转前后PgP(P-glycoprotein)表达。结果：单独应用α-干扰素无逆转作用;联合应用α-干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性,效果优于单用异搏定(P＜0．05);2．5 mg/L异搏定+500pg/mLα-干扰素共同与细胞作用后,PgP表达降低。结论：α-干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用,能显著逆转RCC-925细胞的耐药性,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

IFI44的研究现状

干扰素诱导蛋白44（Interferon-inducible-protein44，IFI44）是一种α／β-干扰素（Inteffemn-α/β，IFN-α／β）诱导基因，参与干扰素信号路径的多种生物学作用，如抗病毒。它能够反映干扰素的活性，在系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）的发病中担任着新的角色。在肿瘤的发病、治疗、放射抵抗方面也发挥着相应的作用。它还是一个潜在的炎症因子，参与了神经毒素引起的神经变性过程。本文对该基因的研究现状做一简要综述。     

乙型肝炎肝硬化的抗病毒治疗

在乙肝肝硬化患者中,活跃的病毒复制与肝炎、失代偿性肝硬化和发展为肝细胞癌(HCC)的风险显著相关.乙型肝炎病毒(HBV)肝硬化患者的5年生存率明显较低.抗病毒治疗已被证明可以降低失代偿性肝硬化或HCC的风险,并延长患者的生存期.建议使用有限疗程的干扰素作为一线用药,对于有干扰素禁忌症或干扰素治疗失败的患者,应及早使用核苷类似物进行治疗.     

α_A人干扰素基因工程菌的改造获重大突破

干扰素是一类重要的抗病毒药物。对乙型肝炎和流行性出血热疗效显著。目前国内已组建成功了α,β,γ干扰素的基因工程菌,忽需开发和应用。近年来我所基因工程研究室的陈伊尼和李梅同志,对正在中试的α_A人干扰素基因工程菌进行研究改造,日前经第二军医大学微生物窒鉴定,活力提高了1000倍,滴度达2×10~(11)单位/升菌液。获得如此高效的表达,     

重组人干扰素α-2b水针、粉针的稳定性及与干扰素标准品的比较研究

研究重组人干扰素α-2b(商品名:安福隆)的稳定性.采用细胞病变法(CPE)检测在4℃贮存条件下放置不同时段的干扰素α-2b水针、粉针和干扰素标准品的抗病毒能力,与标准品比较,评价了水针和粉针的稳定性.结果显示,在4℃的贮存条件下,干扰素α-2b水针和粉针的抗病毒能力基本相同;经两年贮存后,也没有明显地变化,且均比标准品抗病毒能力强.说明干扰素α-2b水针和粉针稳定性均较好,其辅料配方合理,可有效保护干扰素α-2b,减少其降解.     

黄芪多糖对脂肪细胞释放肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-6的影响

目的:探讨黄芪多糖对脂肪细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用及机制.方法由3T3-L1细胞诱导分化成熟的脂肪细胞随机分为实验组和对照组.实验组脂肪细胞以0.1g·L-1黄芪多糖培养基干预,对照组脂肪细胞普通培养基培养.ELISA法测两组脂肪细胞及培养基中TNF-α、IL-6蛋白的含量,及逆转录-聚合酶链反应检测两组脂肪细胞TNF-α蛋白和IL-6蛋白mRNA水平.结果实验组脂肪细胞及培养基中TNF-α、IL-6蛋白的含量低于对照组(P=0.000),而且实验组脂肪细胞TNF-α蛋白和IL-6蛋白mRNA水平低于对照组(P=0.000).结论:黄芪多糖可抑制脂肪细胞释放炎症细胞因子,控制脂肪组织的慢性炎症反应.     

黄芪多糖对新城疫弱毒疫苗免疫雏鸡血凝抑制抗体水平的影响

40只1日龄健康雏鸡随机分成4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为黄芪多糖试验组,每组10只,置于相同的条件下饲养,在第5日龄时对Ⅱ-Ⅳ组每只鸡分别颈部皮下注射0.1mg、0.3mg和0.5mg黄芪多糖注射液,对照组注射生理盐水,每天1次,连续3d,并于第7和21日龄时采用滴鼻、点眼的方式给各组鸡接种新城疫Lasota弱毒疫苗,用β-微量法检测血清中血凝抑制抗体效价的动态变化。结果表明,黄芪多糖对鸡新城疫免疫效果有明显的促进作用,与对照组(Ⅰ组)差异显著,其中以黄芪多糖0.5 mg/只时为最佳使用剂量。由此可见,黄芪多糖在一定剂量范围内可明显增强对鸡新城疫免疫的效果。     

有氧运动结合黄芪多糖对小鼠Lewis肺癌免疫调节研究

探究有氧运动结合不同剂量黄芪多糖对肺癌小鼠免疫调节机制。将Lewis肺癌细胞接种C57BL/6小鼠右侧腋下作为荷瘤模型,荷瘤小鼠被随机分为模型组,阳性药组(环磷酰胺,20 mg/kg),黄芪多糖高(400 mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组,黄芪多糖高剂量(400 mg/kg)辅助游泳运动30 min组,黄芪多糖低剂量(100 mg/kg)辅助游泳运动30 min组,每组10只小鼠。通过计算公式统计各组小鼠的胸腺指数和脾指数,用蛋白免疫印迹法检测瘤块中RORγt和FOXP3蛋白的表达,流式细胞法检测外周血CD4+/CD8+的水平,免疫组化法检测瘤块中IDO的表达。实验结果表明:黄芪多糖能显著稳定增加小鼠脾脏指数(P <0.05),保持胸腺指数稳定;阳性药组显著抑制脾脏和胸腺的生长(P <0.05);有氧运动结合黄芪多糖组可显著降低RORγt的蛋白和m RNA水平(P <0.05),能有效地提高FOXP3的蛋白和mRNA水平(P <0.05)。有氧运动结合黄芪多糖可有效有氧调节肺癌小鼠的免疫,为有氧运动结合黄芪多糖的临床应用提供了依据,也为肿瘤的治疗提供了新的思路。     

黄芪多糖粉针剂的研制及生理活性测定

黄芪(Astragalus mongholicus Bge)在1kg 高压条件下煎煮1.5h,提取得到黄芪多糖(简称 APS),其收率比在常压下煎煮相同时间高一倍。APS 粗品通过 Sephadex G-75精制所得收率为51.6%。对 APS 精品进行黄酮、氨基酸、蛋白质、鞣质、草酸和生物碱等项检查,结果均为阴性。测定精品的总糖含量比粗品高9.43%。APS 经真空低温干燥后制成粉针剂,呈白色粉末,易溶于水。用其行腹腔注射小白鼠,5～7d 后,脾重明显增加。     

猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。