番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

茎瘤芥BjMYB1基因的克隆、表达与遗传转化研究

MYB转录因子广泛地参与了植物细胞分化、细胞周期的调节,激素和环境因子应答等过程。本研究根据茎瘤芥转录组测序筛选获得了一个MYB基因片段。通过RACE的方法,克隆得到了两条长度分别为975bp和864bp的全长序列,分析发现可能为茎瘤芥MYB基因的两种不同选择性拼接形式,并命名为BjMYB1-3和BjMYB1-4。对BjMYB1-3和BjMYB1-4做组织表达分析,发现这两个转录本在茎中特异表达。针对BjMYB1-3和BjMYB1-4的亚细胞定位分析,显示BjMYB1-4定位于细胞核,BjMYB1-3部分定位于细胞核。构建BjMYB-3和BjMYB1-4的超表达载体转化拟南芥,结果显示超表达转化的植株会使拟南芥提前抽薹和开花,说明BjMYB1-3和BjMYB1-4在植株的生长发育过程中起着一定作用,为进一步阐明茎瘤芥BjMYB1基因的功能奠定了基础。     

拟南芥AtDWD与DDB1相互作用研究

本文通过酵母双杂交实验(Y2H)和双荧光互补实验(BIFC)分别从体外和体内条件下检测了AtDWD与CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白结合蛋白DDB1a和DDB1b的相互作用,发现AtDWD与DDB1b有较强的相互作用,而与DDB1a的相互作用较弱,相互作用区域位于AtDWD的C末端部位.说明了AtDWD是潜在的CUL4型E3连接酶的底物识别亚基.此外,本文中还发现AtDWD过表达植株对冷冻胁迫更加敏感.AtDWD可能参与冷胁迫信号通路.     

番茄SlWRKY1转录因子在植物生物和非生物胁迫中的调控

克隆番茄SlWRKY1基因,构建植物过量表达载体pBI121-35S∷SlWRKY1并通过农杆菌介导的遗传转化法转化番茄,成功获得3株过量表达的转基因植株.研究发现:转基因植株对丁香假单胞菌番茄变种(Pst DC3000)的感染表现出敏感性,表明SlWRKY1基因可以减弱由Pst DC3000引起的植物防御反应,在相关信号通路中起到负调控作用.同时SlWRKY1转基因植株对盐胁迫表现出抗逆性,在胁迫条件下转基因植物中积累了大量的脯氨酸.推测SlWRKY1基因可能参与番茄脯氨酸代谢调控.     

AtOSAK1在植物氧化胁迫响应中的功能研究

植物类蛋白激酶ABC1家族(Activity of bc1 complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中扮演着重要的作用.该课题组克隆并研究了ABC1家族中一个的基因At OSAK1.半定量RT-PCR检测及启动子驱动GUS报告基因分析的结果显示,At OSAK1基因的表达无组织特异性,且受甲基紫精(MV)的诱导表达.At OSAK1-GFP亚细胞定位显示,At OSAK1蛋白定位在叶绿体中.不同浓度MV处理条件下,过表达At OSAK1植株的种子萌发率和存活率比野生型(Col-0)和突变体osak1高.这些研究表明,At OSAK1基因参与了抗氧化胁迫的响应.     

茎瘤芥BjMYB1两个转录本的克隆与遗传转化研究

本研究根据茎瘤芥转录组测序筛选获得了一个MYB基因片段.通过RACE的方法,克隆得到了两条长度分别为975bp和864bp的全长序列,分析发现可能为茎瘤芥MYB基因的两种不同选择性拼接形式,并命名为BjMYB1-3和BjMYB1-4.对BjMYB1-3和BjMYB1-4做组织表达分析,发现这两个转录本在茎中特异表达.针对BjMYB1-3和BjMYB1-4的亚细胞定位分析,显示BjMYB1-4定位于细胞核,BjMYB1-3部分定位于细胞核.构建BjMYB1-3和BjMYB1-4的超表达载体转化拟南芥,结果显示相比于野生型拟南芥,BjMYB1-3超表达转基因株系生长状态更好,而BjMYB1-4超表达转基因株系没什么明显变化,说明BjMYB1-3在植株的生长发育过程中起着一定作用.     

PuFAD8基因过表达载体的构建及其在番茄中的遗传转化

脂肪酸去饱和酶8(fatty acid desaturase 8,FAD8)是FAD基因家族成员，可参与催化不饱和脂肪酸的合成进而影响果实香气。为进一步研究PuFAD8基因的功能及其与番茄果实挥发性物质的关系，文章构建了模式植物番茄PuFAD8基因的过表达载体，通过农杆菌介导遗传转化、植物组织培养技术获得番茄PuFAD8基因过表达植株。结果表明，番茄PuFAD8基因过表达载体构建成功，并获得番茄过表达植株，以便进一步研究该基因的分子功能，为明确其在番茄果实成熟过程中挥发性物质的调控机制奠定了基础。     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

番茄中一个抗病基因功能的研究

植物中最大的一类抗病基因(R)编码的蛋白质含有卷曲螺旋结构(coiled-coil,CC)、核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结构域。R基因以抗病著称。文章通过酵母双杂筛选方式获得了DDI3基因,该基因与番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR结构,预测具有R基因抗病性,参与植物抗病。研究中构建了DDI3过表达载体并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,筛选获得DDI3高表达的阳性转基因株系。通过病菌接种实验,观察植株发病情况和统计细菌菌落数,结果发现,转基因植株的抗病性明显高于野生型番茄。DDI3基因对提高番茄的抗病性有很高的价值,为采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的尝试,同时又与番茄DDB1基因具有相互作用,对研究DDB1基因在参与植物抗病途径中的功能研究提供新的方向。     

番茄胞嘧啶甲基转移酶同源基因SlMET1功能研究

真核生物中,DNA甲基化作为表观遗传学修饰的重要手段之一,影响了植物的大量生长发育过程。文章通过生物信息学分析确定番茄中的胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)并对其进行进化关系的分析;利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术从番茄cDNA中扩增出胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)全长,构建SlMET1与绿色荧光蛋白融合表达载体,通过在烟草瞬时表达系统,对其进行亚细胞定位;实时定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同组织中的表达模式;同时,构建SlMET1与HA标签蛋白融合表达载体,通过免疫共沉淀分析其与DDB1的相互关系。研究结果表明:SlMET1基因在番茄各个时期和组织中都有表达,其中,叶片和花中表达量较高,在果实的变色期和红果时期表达量较低;通过绿色荧光融合蛋白载体的表达,确定SlMET1基因只在番茄细胞核中表达;通过免疫共沉淀分析确定SlMET1和DDB1之间存在相互作用。该研究为研究DDB1以表观遗传学的方式调控植物生长发育过程奠定了理论基础。     

一个水稻蛋白激酶的过表达分析及表达调控

对一个预测的具有光反应活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK进行过表达研究,构建了STK过表达载体,并用农杆菌介导的方法进行遗传转化,获得T0代转基因植株.对转基因阳性植株进行表达分析的结果表明,转基因植株STK基因的表达量显著高于对照,说明目的基因得到了过表达.另外,利用获得的过表达转基因植株对STK调控水稻中光周期相关的开花基因Hd1和Hd3a的表达进行分析,结果表明,Hd1及Hd3a的表达在转基因植株中明显上调,表明该蛋白激酶的基因可能位于Hd1和Hd3a上游,对于Hd1和Hd3a的表达具有重要的调控作用.     

一个水稻富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的RNAi及表达分析

为了揭示富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLKs)家族成员OsLPR1在水稻生长发育与抗逆性中的功能,利用反向遗传学方法构建了OsLPR1的RNAi载体,将其导入野生型水稻中获得转基因植株,观察表型并且分析OsLPR1基因在野生型和转基因植株中的表达情况.在表型观察中发现RNAi转基因植株出现白化苗.进一步的RT-PCR分析发现,白化苗中目的基因OsLPR1的表达量明显偏低,野生型中的表达量则较高,这表明OsLPR1基因表达异常会导致水稻出现白化现象.另外,还分析了OsLPR1的组织特异性表达,结果表明,OsLPR1在不同的组织器官中均有表达,但在叶片及叶鞘中高表达,这说明该基因可能与水稻叶片的生长发育有关.     

利用TRV过表达和沉默系统验证植物油脂合成相关基因的功能

为探究烟草脆裂病毒过表达和沉默系统进行油脂相关基因研究的可能性,该研究克隆了拟南芥的WRI1和FAD2基因,分别构建了TRV过表达和沉默载体. 利用瞬时侵染技术侵染本氏烟草,取材料进行RT-PCR和脂肪酸含量检测. 结果显示在过表达WRI1基因的本氏烟草中,侵染叶和非侵染叶的WRI1基因及其相关参与脂肪酸合成基因ACP1、KAS1和BCCP2等都有明显上调,且脂肪酸含量检测结果显示分别增加16%和28%. 在沉默FDA2基因的本氏烟草植株中,发现多不饱和脂肪酸含量分别减少约25%和24%. 因此,利用TRV系统对油脂相关基因进行研究是可能的.     

HMGA1对肝细胞癌的增殖、迁移和细胞周期的作用影响

目的:探究HMGA1对肝癌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响。方法:通过生物信息学、qRT-PCR、蛋白质印迹法分析HMGA1在正常肝组织与肝癌组织、正常肝细胞与肝癌细胞中的表达及其表达量与患者生存期的关系;通过GO和KEGG通路分析HMGA1及其相关基因在肝癌细胞生理活动中可能发挥的作用;MTT、克隆形成、Transwell实验及流式细胞术用于分析下调HMGA1对肝细胞癌的增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。结果:与正常肝组织比较,肝癌组织HMGA1表达上调,且表达水平与患者生存期呈负相关;筛选得出451个正相关基因和398个负相关基因在TCGA-LIHC和GSE15765两个数据集中都具有统计学意义,KEGG和GO分析结果表明HMGA1及其相关基因参与组成细胞组分,并主要影响肿瘤细胞的分裂增殖、转录调控、氧化还原过程和代谢过程等;下调HMGA1抑制肝癌细胞的细胞活力、迁移,诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期;敲低HMGA1使肿瘤体积缩小、重量减轻。结论:HMGA1可能作为原癌基因促进肝癌细胞的生长。     

碳饥饿和盐胁迫处理过表达OsAtg8a水稻转化植株的基因表达分析

为了探究Os Atg8a在水稻碳饥饿和盐胁迫过程中的作用,通过农杆菌介导法获得了过表达Os Atg8a的水稻转化植株.分别对野生型植株和转基因植株进行碳源饥饿处理0、8、16、24和48 h,发现碳饥饿处理时间为0、8、16、24 h时野生型植株和转基因植株中基因表达量均没有发生明显变化,处理48 h时,过表达Os Atg8a植株的Os Atg1a、Os Atg4a、Os Atg8a、Os Atg13a、Os Atg16a和Os TOR基因表达量均显著高于对照植株.盐胁迫处理组合下,发现250 mmol/L Na Cl处理4 h的过表达Os Atg8a植株中,Os Atg8a和Os Atg16a的表达量较未处理的转基因植株表达量明显增加,Os Atg8a的表达量较野生型增加了36倍.针对过表达Os Atg8a转化植株在无碳源和高盐胁迫过程中相关自噬基因表达量明显升高的结果,推测Os Atg8a基因在水稻抗非生物胁迫的过程中具有重要的作用.     

番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究

植物真核翻译起始因子4E（eIF4E）在蛋白质翻译过程中发挥重要作用．最近研究表明eIF4E在参与植物病毒互作,影响病毒在寄主中复制和侵染过程．文中通过RNA干涉调控番茄eIF4E表达,鉴定eIF4E在植物病毒互作中的作用．根据数据库假设性一致序列（TC171564,TC170275）分别克隆了番茄“中蔬五号”SleIF4E基因及其异构体基因SleIF（iso）4E．构建了SleIF4ERNAi抑制表达载体pSL4D,通过农杆菌介导的方法导入番茄品种“中蔬五号”基因组．PCR检测和Southern blot结果表明,目标基因已整合到番茄基因组中．通过半定量RT-PCR对转基因番茄进行eIF4E表达分析,表明pSL4D转化番茄中eIF4E得到不同程度抑制．转基因植株分别接种PVY和CMV两种病毒,病毒ELISA测定和病毒RNA积累量分析表明,pSL4D转化植株相对于对照组均获得不同程度的病毒抗性,番茄eIF4E参与PVY的复制或侵染寄主过程．就不同病毒而言,RNAi对PVY抗性的调控效果比CMV调控效果好,抑制PIF4E表达可提高植物对PVY的抗性．     

1个Avr/Cf介导的差异表达基因在番茄抗叶霉病中作用的基因沉默分析

Avr/Cf介导产生过敏性反应时特异表达的cDNA-AFLP片段,称为ACE(Avr/Cf-elicited)片段,从中挑选1个未知功能的基因(记为ACE5)(GeneBank登录号为CK348288),利用VIGS技术对该片段相应基因进行基因沉默分析,分析该基因在植株生长和发育以及番茄抗叶霉病中的作用。结果表明该差异表达片段相应基因对本氏烟的生长发育以及Avr/Cf介导的HR反应均无影响。     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

乳腺癌中hsa-miR-17-92基因簇及其旁系同源体的共调控作用

hsa-miR-17-92基因簇高度保守,可以作为抑癌基因抑制乳腺癌细胞的增殖.包括2个旁系同源体:miR-106a-363和miR-106b-25基因簇,其序列高度相似,可能通过调控共同靶基因而具有相似的功能.探讨3个基因簇转录的15条microRNA的序列特征,以及共调控靶基因在人类乳腺正常和癌细胞系中的表达;并进一步就显著差异表达基因进行GO和Pathway(KEGG)分析.结果表明,超过75%(178/236)的共调控靶基因表达具有显著差异性,这些基因可能与生物体的细胞代谢、转录后调控、生物合成等多种生物学过程有关,参与细胞周期,癌症等信号通路.分析发现乳腺特异基因PTPN4在乳腺癌中的低表达影响蛋白磷酸化水平和细胞周期,SMAD4、CCND1和E2F1作为与细胞周期相关基因在细胞的G1期起重要作用,它们的低表达阻止细胞从G1期进入S期,从而抑制癌细胞的生长,起到抑癌作用.特别是,一方面基因簇调控CCND1和E2F1使其低表达,另一方面它们作为转录因子结合到基因簇的启动子区诱导基因簇表达,从而形成负反馈调控循环调控下游基因表达.