水稻OsPPDK基因的克隆及生物信息学分析

利用比较基因组学方法,通过小麦TaNAM基因序列来设计引物,在早衰水稻品系金23B中寻找TaNAM的同源基因.对获得的c DNA片段进行序列比对分析,发现其与丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase,PPDK)基因高度同源,因此将其命名为OsPPDK(Oryza sativa PPDK).为进一步探索OsPPDK基因的功能及其与叶片衰老的关系,根据水稻预测OsPPDK基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆出OsPPDK基因的编码区,并进行生物信息学分析.结果表明:该基因全长为3 515 bp,包含一个完整的ORF,编码区长2 844 bp,编码947个氨基酸,分子量为102. 79 k D,所编码的氨基酸序列与其他已知的植物来源的PPDK基因相比,相似性大多在80%以上.在PPDK基因所编码的氨基酸序列中,发现了一个PEP利用酶位点信号,3个N-糖基化位点和15个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点和一个PEP利用酶位点.同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构.     

水稻温敏核不育系HD9802S不育性遗传的初步观察

以水稻温敏核不育系HD9802S配组的HD9802S／湘早92和HD9802S／荆楚15的F1和F2代为材料,对这两个杂交早籼稻组合F2群体的花粉育性进行了观察分析．结果表明,F2群体中可育株数和不育株数经卡平方测验符合3：1的理论比例,初步确定温敏核不育系HD9802S的雄性不育性由一对主效隐性核基因控制;同时根据F2群体花粉育性表现出连续分布的特征,推测其雄性不育性还受其他微效基因的影响。     

一种改良的水稻总DNA提取方法

在植物DNA提取“SDS法”基础上,提出了一种改良的DNA提取方法,称“剪切法”.采用“剪切法”、“液氮法”和“钢珠法”3种方法提取水稻幼叶总DNA并进行了电泳分析和PCR检测,同时首次选择了以幼穗为提取材料,用“剪切法”分别提取水稻幼穗、幼叶和老叶的总DNA并进行比较,结果表明:“剪切法”是一种简易、经济、高质的DNA提取方法,对于以F2极端分离群体作为基因定位群体,取幼穗为提取水稻总DNA的材料是一种经济便捷的途径.     

温敏核不育水稻HD9802-9S育性相关基因的BSA测序初步分析

HD9802-9S是以HD9802S为母本、以固优12为父本杂交选育的一个温敏核不育系。人工气候箱鉴定该不育系转育起始温度高于HD9802S,表明HD9802-9S和HD9802S两个品系的育性调控基因有差异。构建HD9802-9S/R446 F_2群体和HD9802-9S/R144 F_2群体,每个群体中随机选择100个不育单株和100个高度可育单株分别构建可育混池和不育混池进行BSA重测序。统计并计算每个BSA重测序结果的ΔSNP-index值,并以95%和99%置信水平作为筛选的阈值。高于95%置信水平的ΔSNP-index定位于2号染色体上总长为3. 24 Mb的候选区域和7号染色体上0. 69 Mb长度的候选区域内;高于99%置信水平的ΔSNP-index定位于2号染色体上总长为1. 87 Mb的候选区域内,在7号染色体上没有候选SNP,两个群体的定位结果相同。因此,HD9802-9S的不育主效基因定位在2号染色体,7号染色体上可能存在其他控制育性的QTL位点。HD9802-9S的2号染色体上存在64个控制花粉育性表达的候选基因。这些结果为进一步研究它们与tms5之间的关系奠定基础。     

碳饥饿和盐胁迫处理过表达OsAtg8a水稻转化植株的基因表达分析

为了探究Os Atg8a在水稻碳饥饿和盐胁迫过程中的作用,通过农杆菌介导法获得了过表达Os Atg8a的水稻转化植株.分别对野生型植株和转基因植株进行碳源饥饿处理0、8、16、24和48 h,发现碳饥饿处理时间为0、8、16、24 h时野生型植株和转基因植株中基因表达量均没有发生明显变化,处理48 h时,过表达Os Atg8a植株的Os Atg1a、Os Atg4a、Os Atg8a、Os Atg13a、Os Atg16a和Os TOR基因表达量均显著高于对照植株.盐胁迫处理组合下,发现250 mmol/L Na Cl处理4 h的过表达Os Atg8a植株中,Os Atg8a和Os Atg16a的表达量较未处理的转基因植株表达量明显增加,Os Atg8a的表达量较野生型增加了36倍.针对过表达Os Atg8a转化植株在无碳源和高盐胁迫过程中相关自噬基因表达量明显升高的结果,推测Os Atg8a基因在水稻抗非生物胁迫的过程中具有重要的作用.     

水稻抗逆性基因OsGATA23可变 剪切的生物信息学分析

水稻OsGATA家族第Ⅶ亚家族基因OsGATA23有两个成员,其中一个成员OsGATA23a是多应激反应转录因子,在盐碱度ABA处理和干旱条件下高度表达.利用生物信息学技术,从核酸和蛋白层面分析OsGATA23a亚基在非生物胁迫下显著表达,OsGATA23b亚基在该胁迫下不表达或低表达的影响因素.结果表明,OsGATA23基因的两个亚基蛋白结构的稳定性不同引起表达不同.首先,运用生物信息学技术对GATA23的蛋白性质、功能、结构进行分析;其次,对启动子顺式作用元件进行统计分析.比对水稻OsGATA23基因亚基及亚基差异氨基酸序列的理化性质发现OsGATA23a-1蛋白结构比较稳定.OsGATA23a平均亲水系数为0.327,该段氨基酸序列疏水.OsGATA23a-1氨基酸序列段存在信号肽位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化活性位点,而OsGATA23b-1不存在.在OsGATA23a-1中α螺旋显著减少,延伸链显著增加.OsGATA23b-1中α螺旋减少,无规则卷曲显著增加.对OsGATA23a和OsGATA23b蛋白三级结构模拟发现其亚基结构组成大致相似,对OsGATA23a-1、OsGATA23b-1蛋白三级结构模拟时,发现OsGATA23b-1在计算机算法上不存在稳定的三级结构构象,而无法模拟.OsGATA23基因启动子序列正反链上存在较多与逆境、根等相关的顺式作用元件.在非生物应激状态下,上游相关顺式作用元件选择性识别下游基因OsGATA23成员中具有比较稳定的疏水蛋白结构OsGATA23a亚基,同时在OsGATA23a-1存在信号肽位点,说明OsGATA23a-1不仅有利于OsGATA23a亚基蛋白结构的优化,而且还能被特异性识别.OsGATA23b亚基在逆境状态下不表达或低表达,说明OsGATA23b-1不利于OsGATA23b亚基蛋白结构稳定,且不能被特异性识别.     

水稻温敏核不育系HD9802S不育基因的SSR标记定位

使用分子标记辅助选择可以获得目标性状的个体从而提高育种效率.以HD9802S/(HD9802S/R287) BC1群体为材料,利用BC1群体中随机选择的32个高度不育单株和32个高度可育单株,以及涵盖水稻12条染色体的22个SSR标记,通过连锁分析进行染色体定位,将温敏核不育基因(HDtms)定位于第2号染色体上;利用软件QTL Ici Mapping 3. 0进行染色体分群,HDtms被划分到第2号染色体上.在第2号染色体上覆盖筛选得到10个SSR标记,以回交群体中428个单株为材料绘制连锁图谱,图谱全长112. 21 cM,平均图距为11. 21 cM,HDtms在标记RM5897与RM12783之间.在此区间内筛选到与HDtms连锁紧密的SSR标记.其中RM12747是得到筛选率最高的分子标记,为90. 135%,且在HD9802S与R287间具有多态性.说明对温敏不育性的分子标记辅助选择可初步使用该分子标记.     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.