茎瘤芥BjMYB1基因的克隆、表达与遗传转化研究

MYB转录因子广泛地参与了植物细胞分化、细胞周期的调节,激素和环境因子应答等过程。本研究根据茎瘤芥转录组测序筛选获得了一个MYB基因片段。通过RACE的方法,克隆得到了两条长度分别为975bp和864bp的全长序列,分析发现可能为茎瘤芥MYB基因的两种不同选择性拼接形式,并命名为BjMYB1-3和BjMYB1-4。对BjMYB1-3和BjMYB1-4做组织表达分析,发现这两个转录本在茎中特异表达。针对BjMYB1-3和BjMYB1-4的亚细胞定位分析,显示BjMYB1-4定位于细胞核,BjMYB1-3部分定位于细胞核。构建BjMYB-3和BjMYB1-4的超表达载体转化拟南芥,结果显示超表达转化的植株会使拟南芥提前抽薹和开花,说明BjMYB1-3和BjMYB1-4在植株的生长发育过程中起着一定作用,为进一步阐明茎瘤芥BjMYB1基因的功能奠定了基础。     

珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定

为探究AP2/ERF类转录因子在珙桐开花调控及花器官发育中的作用,本研究通过从实验室珙桐不同发育时期苞片和叶片的转录组数据中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2/ERF家族基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1,经过生物信息学分析、基因克隆及功能鉴定初步研究了目的基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制.亚细胞定位实验显示DiAP2-1主要定位于细胞质,DiDREB-1和DiRAV-1主要定位于细胞核.对目的基因在珙桐中的表达模式分析发现DiAP2-1和DiRAV-1在苞片发育过程中表达量逐渐降低,DiDREB-1只在苞片第三时期高表达,推测DiDREB-1、DiRAV-1属于A类基因,DiAP2-1属于B类基因.表型实验显示DiDREB-1和DiRAV-1转基因拟南芥株系较野生型表现为明显的早花,DiAP2-1同源基因对应的拟南芥突变体与同一时期野生型拟南芥对比表现为花瓣减少且萼片大,角果呈短粗状且败育.对关键开花调控基因表达模式分析发现DiDREB-1和DiRAV-1异源表达后使其他促花因子表达量上调进而使拟南芥花期提前.以上结果表明,AP2/ERF类转录因子DiAP2-1、D...     

MYB家族转录因子OsMYB84通过ABA信号通路参与盐胁迫响应

MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一,功能广泛,这类蛋白在植物器官形态建成、次生代谢、激素代谢和信号途径起关键调控作用.从水稻中克隆R2R3-MYB家族转录因子OsMYB84,聚类分析结果表明OsMYB84为拟南芥MYB84同源基因,洋葱表皮亚细胞定位研究显示OsMYB84为核定位蛋白.器官表达谱和原位杂交分析实验显示OsMYB84在水稻叶枕、茎以及根中高表达.构建OsMYB84过表达体系,筛选出纯合株系.与野生型相比,OsMYB84转基因水稻的株高明显矮化,因此推测OsMYB84可能通过影响茎和叶枕处侧生分生组织进而改变株高.另一方面,激素和胁迫表达谱分析结果表明,OsMYB84受到ABA、高盐的显著诱导.同时,OsMYB84显著提高了转基因水稻的耐盐特性,减少细胞损伤并且也提高了转基因水稻种子对ABA的敏感性,这暗示着OsMYB84基因可能通过依赖ABA信号通路参与水稻盐胁迫应答反应.     

拟南芥AtJ70的组织特异性表达及亚细胞定位

以野生型和PAtJ70∶GUS转基因拟南芥为材料,以定量PCR和GUS染色方法研究了拟南芥J-蛋白AtJ70的组织特异性表达.结果显示AtJ70基因在根、茎、叶、花和果实中都有表达,花和叶中表达最高,长角果和根中次之,茎中最低.此外,以AtJ70-mGFP4转基因拟南芥为材料,使用激光共聚焦显微镜研究了AtJ70的亚细胞定位.结果显示,AtJ70主要定位于细胞核中.     

拟南芥谷氨酰tRNA合成酶同其相互作用蛋白VDAC的转录水平分析

本研究在基于前期对拟南芥VDAC（电压依赖性阴离子通道蛋白质）与AtGluRS（谷氨酰tRNA合成酶）两种基因的过量表达和抑制表达转基因突变体株系的初步生理性状分析基础上,对筛选获得的转基因T1代植株以及拟南芥abi1、abi2突变株,进行转录水平两种蛋白特异性基因片段的地高辛标记Northern杂交以及半定量RTPCR分析.结果显示,在拟南芥abi1、abi2突变株中,VDAC和AtGluRS两种基因的转录表达均收到不同程度的抑制;而VDAC与AtGluRS两种基因之间存在间接或直接的正调控关系,进一     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

乌塌菜叶绿素降解代谢调控相关基因BcNYE1的克隆和分析

采用电子克隆策略结合RT-PCR从乌塌菜中分离得到了AtNYE1的同源基因BcNYE1完整编码区序列,并对其进行基因组组成和功能研究.BcNYE1的开放阅读框(ORF)长870 bp,编码289个氨基酸残基;基因组序列全长为1 132 bp,有2个内含子和3个外显子.为了验证BcNYE1基因的功能,构建了植物双元表达载体pCHF4-BcNYE1,采用冻融法导入农杆菌GV1301,通过花蕾浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1.对所获得的卡那霉素抗性植株进行PCR、RT-PCR检测,结果表明,在得到的转基因株系中,BcNYE1基因已整合到受体植物基因组中,并且可以转录成mRNA.互补实验结果显示,BcNYE1基因不具备互补拟南芥滞绿突变体nye1-1叶绿素降解缺陷的功能.     

拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

拟南芥VHA-c3基因的特异性表达和调节

利用RT-PCR技术检测VHA-c基因在拟南芥中的表达，结果表明VHA-c3基因在拟南芥的果荚、花、叶、茎和根中都有表达，但是，在叶中的表达量远远高于其它的组织.以GUS基因作为报告基因构建了不同长度的VHA-c3基因启动子缺失突变体，利用农杆菌介导的瞬时表达系统检测GUS基因的表达，研究发现在VHA-c3基因起始密码子上游2812-2 234 bp之间的区域內存在着控制VHA-c3基因高表达的转录调控元件.     

拟南芥RING finger结构域AtHHR1基因的功能初步研究

为了研究拟南芥基因AtHHR1(编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶)是否参与热胁迫响应,构建了athhr1/AtHHR1互补转基因株系.对突变体、互补株系及野生型进行热胁迫处理,发现突变体的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型,而互补株系均低于野生型.通过real-time PCR定量检测发现,热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型中高.研究结果初步表明AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用.     

珠眉海棠（Malus zumi Mats）盐应答MzDREBb基因的克隆与功能研究

通过microarray（微列阵芯片）分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的MzDREBb基因全长cDNA序列,研究苹果属植物DREB转录因子在胁迫中的作用。结果表明：MzDREBb全长1 185bp,开放阅读框共714bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是121和350bp;MzDREBb编码237个氨基酸,有一个AP2/ERF结构域;系统分类将MzDREBb归入DREB家族的A-5亚组;MzDREBb定位在细胞核中,具有转录激活活性;半定量RT-PCR表明MzDREBb基因受到盐诱导。超表达MzDREBb基因的拟南芥耐盐能力增强。以上结果表明MzDREBb基因在盐胁迫应答中起重要作用。     

拟南芥AtRAC在盐胁迫应答中的功能研究

本实验所研究的拟南芥AtRAC含有两个RING结构域和三个蛋白激酶C保守区域1结构域即C1结构域.通过体外泛素化证明了AtRAC具有E3连接酶活性,亚细胞定位实验结果表明AtRAC定位在细胞核中.组织特异性分析表明AtRAC在根中的表达量很高,但是在茎、叶和花中的表达量较低,而且AtRAC的表达受到NaCl胁迫的诱导.进一步对atrac突变体的分析表明,在NaCl处理下,突变体atrac的萌发率降低,侧根数目也降低.初步研究表明拟南芥AtRAC可能是一个与盐胁迫应答相关的基因.     

谷氨酰tRNA合成酶转基因拟南芥的生长特性分析

以不同独立株系的拟南芥谷氨酰tRNA合成酶（Arabidopsis glutamyl tRNA synthetase,简称AtGluRS）过量表达的三种纯合株系（GS3、GS4、GS6）及抑制表达的三种纯合株系（GAS2、GAS3、GAS7）为实验材料,分析其生长情况和表型.表型分析结果表明,拟南芥谷氨酰tRNA合成酶过量表达植株表现出开花晚、基叶多、茎生长快等与对照和AtGluRS抑制表达植株不同的特点.此外,用氯化钠（NaCl）模拟盐胁迫环境,对转基因植物的萌发率和生长情况进行分析,发现谷氨酰tR     

茶树糖基转移酶基因CsUGT73D1的研究

茶树鲜叶中,对茶饮色、香、味品质形成具有重要作用的风味化合物,常由糖基转移酶催化、生成糖苷化合物。其中,一些物质的合成受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导。本研究基于茶树转录组数据库,发现糖基转移酶基因CsUGT73D1为MeJA诱导。该基因编码序列长1470bp,编码具有489个氨基酸残基的糖基转移酶,与葡萄、拟南芥和可可同源基因(VvUGT73D1、AtUGT73D1、TcUGT73D1)在系统进化分类上同属一组。实时定量PCR结果表明,CsUGT73D1基因在叶、雌蕊、花瓣和雄蕊中都有表达,但表达模式不同;其表达受MeJA、GA和ABA诱导。CsUGT73D1与GFP融合蛋白的瞬时表达结果表明,该蛋白定位于细胞质中。过表达该基因的转基因烟草和拟南芥生长发育进程加快、叶片腺毛减少。此外,转基因烟草叶片的分泌型腺毛数量比对照叶明显减少。因而推测,CsUGT73D1作用于多个生物学途径。     

新疆无苞芥OpNAC083基因的克隆与表达分析

本研究通过对新疆耐逆植物无苞芥幼苗c DNA文库的随机克隆测序分析,获得1条与拟南芥NAC转录因子基因At NAC083高度相似的EST序列(Gen Bank登录号为JZ151841),该序列包含1个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从无苞芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op NAC083。比对分析结果表明在其N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白的二级结构包含33个α-螺旋和11个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op NAC083编码产物与拟南芥At NAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达结果显示,Op NAC083在无苞芥的不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理2 h、ABA处理6 h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因的表达。这表明Op NAC083在无苞芥应对盐和ABA胁迫中可能起着重要作用。     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

灌木柳SlSIP基因的克隆和功能验证

【目的】明确灌木柳碱性α-半乳糖苷酶基因(SlSIP)的结构特征和该基因在耐盐方面的生物学功能,为碱性α-半乳糖苷酶基因新的功能拓宽提供理论基础。【方法】 以灌木柳苏柳‘2345’(Salix jiangsuensis ‘2345’)盐胁迫48 h后的cDNA为模板,克隆了苏柳碱性α-半乳糖苷酶基因SlSIP。运用生物信息学方法分析其蛋白质结构、性质和亲缘关系,利用农杆菌介导法转入拟南芥中,通过实时荧光定量qRT-PCR方法鉴定转基因阳性植株的表达特性和盐胁迫条件下的生长状态,从而验证转基因植株的耐盐功能。【结果】该基因编码776个氨基酸,分子质量为84.88 ku,理论等电点为5.85,不稳定系数为35.74,亲水性平均系数-0.154, 定位于内质网膜上。SlSIP的保守结构域为WFGWCTW和IDDGWQ,催化活性位点为V。共得到11个T3代阳性转基因株系,qRT-PCR结果显示SlSIP在3个拟南芥阳性转基因株系中表达量最高,分别提高9、28、29倍。转基因株系在含85 mmol/L NaCl培养基上种子萌发率高于非转基因植株,且生长状态良好,但非转基因植株的叶绿素含量高于转基因株系。【结论】SlSIP基因属于GH27家族,不仅提高了种子萌发过程中的耐盐性,也参与了叶片发育和衰老的途径。