新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用

CRISPR-Cas系统是新近在原核生物中发现的一种抵御外来DNA入侵的免疫机制,由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成,广泛分布于真细菌和古菌中.CRISPR由重复序列及其间隔序列组成,间隔序列来自于过去的入侵DNA,并插入到细菌的CRISPR排列中.一旦出现新的入侵,CRISPR转录,其RNA经过加工后与Cas蛋白质组成一个核蛋白复合体,该复合体通过RNA与入侵DNA序列之间的互补配对,结合目标序列,最后Cas蛋白质将入侵DNA降解.此外,基于CRISPR系统中的Cas9蛋白,发展了一种新的基因组编辑技术,在不同的细胞中均能获得高效的基因定点打靶,展现出巨大的潜力.     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

CRISPR/dCas9在细菌转录调控中的应用及展望

CRISPR/dCas9是以CRISPR/Cas9系统为基础发展而来的转录调控工具.本文综述了CRISPR/dCas9作为转录抑制工具(CRISPRi)和转录激活工具(CRISPRa)的发展及应用,总结了在细菌中应用CRISPR/dCas9系统时转录调控系统的选择、构建、靶位点的选择以及gRNA的设计等方面存在的问题,并对相关解决方法进行了展望.     

张锋团队发布CRISPR全新诊断系统

<正>美国博德研究所张锋团队在近日出版的《科学》杂志上发表论文称,他们用另一种剪切酶Cas13a取代CRISPR/Cas9中的Cas9,将原本靶向DNA(脱氧核糖核酸)的基因编辑工具延伸为靶向RNA(核糖核酸)的全新诊断系统,灵敏度甚至高到能检测出单个目标核酸分子,有望给基础研究、传染病诊断治疗等带来革命性影响。2016年6月,张锋和同事首次发表论文称,CRISPR/Cas13a能精确剪切细菌细胞中的特定RNA序列。但与Cas9     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.     

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望为将基因编辑更好地应用于花卉育种提供参考.     

CRISPR/Cas系统在谱系追踪中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌的自适应免疫系统,其对基因组高效精准的编辑,极大地推动了发育生物学、表观遗传学、药物开发、疾病治疗等多个学科和研究领域的发展.CRISPR/Cas9系统诱导基因组DNA产生双链断裂,以非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)的方式进行修复,因此会在剪切位置随机地引入短的插入和删除(insertions and deletions,indels).这些引入的indels作为区分细胞的标签,被称为条形码.细胞条形码技术已经被用于谱系追踪、基因组功能筛选等.而测序技术的飞速发展和成本的大幅度降低以及单细胞转录组测序技术的出现,可以在时间和空间层面同时对数百万个单细胞进行谱系追踪,记录细胞活动.本综述讨论了CRISPR/Cas系统的工作原理、细胞条形码技术和单细胞测序技术(scRNA-seq),以及两者结合产生的单细胞谱系追踪技术.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

木本植物育种周期长、种质资源匮乏,已成为限制木本植物种质创新的主要因素。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术,具有操作简单、周期短、效率高等优点,可实现基因的敲除、插入、替换等目的,从而精确地引入目标性状。目前,该技术已在多种家畜、昆虫、作物中得到了成功应用,对大量性状进行了改良,实现了种质资源的原始创新,大大缩短了育种年限。CRISPR/Cas技术的产生为木本植物的遗传改良提供了契机。笔者对CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、木薯(Cassava spp.)等木本植物育种中的应用进行了总结,该技术实现了T0代木本植物优良基因型的固定,在生长、材性、抗病性、抗旱性等性状上得到了明显改善,加快了木本植物育种进程,提高了育种效率。但该技术在木本植物中的应用尚处于起步阶段,还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等问题。基于此,对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用前景进行了展望,以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。     

基因编辑方法研究进展——以大肠杆菌基因敲除方法为例

大肠杆菌是分子生物学的重要研究对象,是生产氨基酸、有机酸和重组蛋白等物质的主要微生物.在分子生物实验中,常常不需要完整的大肠杆菌基因序列,这时如何截取所需要的基因序列就成了值得研究的问题. Red同源重组是大肠杆菌基因敲除的传统方法,主要利用自身的Rec A同源重组系统编码中Rec A和Rec BCD蛋白,介导DNA进行同源重组.几经技术革新,但该系统仍然存在很多不足.基因组编辑三大技术是TALEN、ZFN和CRISPR/Cas,其中的CRISPR/Cas技术更是当今世界上最具发展前景的革命性基因修饰技术.     

基因编辑技术原理及其在动植物研究中的应用

自人类基因组计划开展以来,越来越多生物的基因组序列得到了测定,基因的功能逐步得到鉴定.人们期望通过对基因表达的改变,来治疗人类疾病或提高生物的产量和品质.早期突变技术对基因的改变是不定向的,近年来,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等技术可对某个已知基因进行编辑.特别是CRISPR/Cas9技术,由于具有操作方便、效率高等优点,因此成为对基因进行定向操作的强有力工具.本文对几种基因编辑技术的原理和应用进行简要介绍和展望.     

CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼park2基因的定点敲除

作为目前最新、最先进的基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统为分子细胞生物学带来革命性发展,以它的简单高效、灵活性以及可实现DNA序列的定向突变而被广泛使用.斑马鱼的park2基因位于第13号染色体上,编码的Parkin蛋白是一个E3泛素连接酶.该基因在斑马鱼中的功能还不清楚.利用CRISPR/Cas9系统,首次在斑马鱼胚胎中实现了park2基因的大片段删除.由于斑马鱼在发育和疾病研究中有很大优势,实现park2基因敲除将有助于将来进一步研究该基因的功能.     

靶向RNA的CRISPR-Cas13系统及其研究进展

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins)系统是细菌和古菌抵御外源核酸物质入侵的适应性免疫系统,发挥作用时经过3个阶段:适应阶段、表达阶段和干扰阶段.其中,靶向DNA的CRISPR-Cas9研究较为深入,在基因组编辑领域具有广泛应用.而靶向RNA的CRISPR-Cas技术仍处于初步研究阶段.CRISPR-Cas13系统(Cas13a-d)的发现为RNA编辑等领域提供了新思路.Cas13家族蛋白是RNA介导的具有RNase活性的效应蛋白,结构上有保守的HEPN结构域(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding domain),能自我加工precursor crRNA和切割靶RNA.从Cas13家族蛋白的发现与基本功能、结构基础,以及在病毒核酸检测、RNA编辑、疾病治疗等方面的应用进行综述,旨在为CRISPR-Cas13系统的合理改造和应用奠定基础.     

第二大类CRISPR-Cas系统在肿瘤研究的应用

第二大类CRISPR-Cas系统具备多重基因编辑修饰功能,仅由单效应蛋白介导完成干扰过程,包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统,及识别并切割单链RNA的Cas13系统.综合介绍第二大类CRISPR-Cas系统的结构与功能基础、作用机制,及其在构建肿瘤模型、肿瘤免疫治疗、耐药性研究、核酸检测等方面的应用,为进一步开发CRISPR-Cas工具并应用于临床医学研究提供参考.     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

生物安全型无标记转基因植物培育策略

对基于共转化、位点特异性重组、转座子系统、染色体重组、基因叠加和基因定点修饰技术(TALENs、ZFNs、CRISPR/Cas)的筛选标记基因剔除策略进行综述,就其优缺点进行了比较分析.