使用差异定位SunTag组件实现对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察

生物过程由数百万个蛋白质驱动.蛋白质结构和蛋白质定位是蛋白质行使功能的关键.在过去的研究中,快速发展的荧光显微镜成像技术使研究人员可以直接观察蛋白质在活细胞内的定位.然而,对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察仍然存在技术障碍.我们通过改进SunTag标记技术,使用差异定位的SunTag组件:一方面,在研究目的蛋白(POI)上标记多个V4抗原;另一方面,将识别V4抗原的抗体GCN4融合的绿色荧光蛋白(GCN4-GFP)通过差异定位后限制其与抗原的结合量.我们的方法大大降低了背景荧光信号,实现了对dynamin膜上功能单位的直接可视化.     

一种检测蛋白质相互作用的双荧光共定位系统

自发荧光蛋白以快捷灵敏、即时检测和无需破坏活细胞的特点在蛋白质相互作用的研究中得到广泛应用.从发光水母Aquoria victoria中分离的绿色荧光蛋白(GFP)和从珊瑚Discosoma sp.中分离的DsRed红色荧光蛋白是自发荧光蛋白的典型代表.本研究开发一种基于GFP和红色荧光蛋白(RFP),并可通过待检测蛋白在细胞内表达的空间位移变化产生共定位的双荧光共定位检测系统.该系统为克服两种荧光蛋白光谱渗漏带来的非特异性结果的干扰,将核仁定位信号(NoLS)和出核信号(ABL)分别连接到RFP和GFP.具有定位信号的GFP和RFP的待检测蛋白对可分别在细胞核内和(或)细胞核外表达,伴随它们的相互作用,荧光共定位的现象会产生在细胞内特定的区域.利用抗凋亡蛋白Bc1-2和Bak-BH3短肽作为蛋白对测试该系统,荧光共定位现象明显,系统灵敏可靠.     

实时观测基因编辑

<正>一项于2019年9月5日发表在Science上的研究为我们介绍了一种新技术——CRISPR活细胞荧光原位杂交(LiveFISH)技术。该技术实现了在活细胞中实时观测单个细胞的DNA和RNA片段,从而实时追踪基因组的编辑、转录、重排以及功能变化。研究人员将失去"剪刀"功能的蛋白质dCas9和带有荧光染料的向导RNA组合在一起,便可靶向标记活细胞中特定的基因组序列(右图),帮助检测     

利用CRIS-PITCh系统构建原位表达CEP290-EGFP的细胞系

初级纤毛是一种存在于脊椎动物大多数细胞表面的细胞器,主要参与胚胎发育和传导胞外信号。在纤毛生长的过程中,过渡区关键蛋白CEP290主要定位在中心体上,而CEP290表达或定位异常影响初级纤毛的结构和功能。本实验基于一种新型基因敲入技术——CRIS-PITCh系统,通过微同源介导末端连接方法,以实现将绿色荧光蛋白EGFP编码序列插入CEP290基因中,最终构建融合表达CEP290-EGFP蛋白的人视网膜色素上皮细胞系。因此,我们可以通过荧光成像直接观察内源CEP290的动态定位,为今后进一步研究CEP290的功能提供更好的工具和方法。     

荧光成像在活体蛋白质研究中的应用

蛋白质的动态特性对蛋白质在细胞内的功能有重要作用.荧光标记、活体内荧光成像技术及显微镜系统的共同进展为人们提供了活细胞内研究蛋白质动态变化及其相互作用的手段.综述了荧光成像技术的进展及其活体内研究蛋白质动态特性中的应用.     

双分子荧光互补技术及其在蛋白互作研究中的应用

双分子荧光互补（bimolecula fluorescence complementation,BiFC）是近年新发展起来的在活细胞中研究蛋白质互作及其定位的新技术．该技术巧妙的将荧光蛋白切成不发光的两个片段,并与目的蛋白融合表达．如果目的蛋白相互作用,连接其上的荧光互补蛋白片段将会相互靠近并恢复荧光活性,从而实现了分子与细胞事件的可视化．BiFC既可以验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱,还可以定位互作蛋白的位点．基于双分子荧光蛋白的应用已经越来越广泛,本文对双分子荧光互补技术的原理、应用现状、特点及其面临的问题进行了概述．     

果蝇锌离子转运蛋白Catsup亚细胞定位分析

Catsup是果蝇体内一个功能重要的基因,其突变会导致体内多巴胺含量过高,引起果蝇致死及生殖障碍.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在确定蛋白的亚细胞定位进而在研究蛋白功能方面起着重要的作用.为了探索Catsup的亚细胞定位进而能够更好地研究Catsup的功能,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Catsup基因全长,与GFP一起连接至pUAST质粒,构建载体pUAST-Catsup-GFP,通过显微注射技术导入果蝇,获得UAS-Catsup-GFP转基因果蝇.通过克隆验证了转基因果蝇构建成功.利用该果蝇进行Catsup的亚细胞定位,确定其定位在高尔基体上,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

金堂黑山羊FSH受体基因在酿酒酵母细胞中的表达与定位

通过激光共聚焦显微镜对卵泡刺激素受体（FSHR）FSHRA和FSHRB与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白的表达和定位进行观察,发现FSHRA和FSHRB不仅在酿酒酵母细胞中有表达,而且表达的蛋白质主要定位在酵母的细胞膜上.     

嗜水气单胞菌感染暗纹东方鲀脾脏的蛋白质组学分析

为了解暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)受到病原菌感染后参与应答的主要蛋白的功能与调控作用,采用TMT标记、高效液相色谱(HPLC)分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术,分析了暗纹东方鲀感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)12 h后脾脏组织的蛋白表达水平,鉴定差异表达蛋白,并通过亚细胞定位、GO(Gene Oncology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达蛋白进行进一步分析.本次实验共鉴定到306个差异表达蛋白,其中120个上调表达蛋白,186个下调表达蛋白;利用平行反应检测实验(PRM)对4个(1个上调,3个下调)与免疫相关的差异蛋白进行验证,其结果与蛋白质测序结果一致;亚细胞定位结果显示:差异表达蛋白主要定位在细胞质、细胞核和胞外;GO分析发现:差异表达蛋白参与的主要生物进程有代谢过程、细胞进程和单一生物进程,主要的分子功能有结合、催化活性和机构分析活性;KEGG通路分析结果显示:差异表达蛋白主要参与了核糖体、视黄醇代谢、卟啉和叶绿素代谢、ECM受体相互作用、吞噬体、叶酸生物合成、药物代谢、酪氨酸代谢等通路.研究结果为进一步探究病原菌感染暗纹东方鲀的致病机理提供了一定的理论基础.     

文蛤抗癌多肽抑制肝癌细胞SMMC-7721差异蛋白质组分析

为了研究文蛤抗癌多肽对肝癌细胞抑制作用的蛋白表达差异,寻找并鉴定差异蛋白质,探讨多肽抑制肝癌细胞的作用机理,本文通过双向电泳、考马斯亮蓝染色、Melanie 4双向软件分析、质谱技术(MALDI-TOF-MS)和数据库检索分析多肽作用SMMC-7721后的差异蛋白质.利用差异蛋白质组方法分析了抗癌多肽对肝癌细胞SMMC-7721抑制后的蛋白变化,找到差异点并进行了质谱鉴定(MALDI-TOF-MS).结果表明,通过对差异蛋白功能的分析,推测抗癌多肽可能引起了肝癌细胞的凋亡,为进一步的抗癌多肽抑制肝癌细胞作用的研究提供了理论基础.     

小凹蛋白-1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达

为探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达及定位,为进一步功能研究提供理论依据,采用Western-blot和Rt-PCR及免疫荧光技术检测HUVEC中小凹蛋白-1与细胞外钙受体mRNA和蛋白表达及定位.结果显示:(1)形态学观察和免疫细胞化学法测Ⅷ因子抗原,95%以上的细胞呈阳性着色,证实细胞为HUVEC.(2)RT-PCR检测到HUVEC中459bp和260bpmRNA表达,Western-blot测到HUVEC中22KD和150-160KD蛋白表达.(3)免疫荧光检测到小凹蛋白-1与细胞外钙受体定位于人脐静脉内皮细胞膜.由此可知,人的HUVEC中有小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达,两者是否共定位及其功能有待进一步研究.     

含Syntaxin 1A基因的SFV表达载体的构建与表达

用绿色荧光蛋白 (EGFP)标记了Syntaxin 1A(Syn1A)蛋白 ,构建了含有EGFP Syn1A融合蛋白的森林脑炎病毒表达载体 pSFV1 EGFP Syn1A ,测序结果表明表达载体构建正确 .用荧光显微成像技术研究了Syn1A在原代大鼠胰腺 β细胞中的定位 ,结果表明Syn1A主要定位于细胞质膜上 .     

应用绿色荧光蛋白标记技术研究钙调激Ⅱ在HeLa细胞中的分布

采用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术研究钙离子钙调素依赖性蛋白激毒Ⅱ(CaMKⅡ）在HeLa细胞中的分布，为了研究细胞风钙离子钙调素信号的下游作用物，我们首先构建了CaMKⅡ与GFP的融合基因，磷酸钙沉淀法将pCaMKⅡ－GFP重组载体导入HeLa细胞，通过荧光显微镜观察，发现在细胞间期，CaMKⅡ－GFP融合蛋白主要分布于细胞核中，细胞质中亦有少量分布，这一分布不同于绿色荧光蛋白在间期细胞内的动匀分布，同时讨论了与间接免疫荧光染色方法相比，GFP技术在功能蛋白定位研究上的应用优势。     

拟南芥CARK4与RCAR12相互作用的研究

本研究采用酵母双杂交(Y2H)、GST-融合蛋白沉降技术(GST-pull-down)及双分子荧光互补实验(BiFC)实验方法研究蛋白质激酶CARK4与脱落酸受体RCAR12之间的相互作用.酵母双杂交(Y2H)试验显示,缺失氮端的CARK4(CARK4ΔN)与RCAR12具有明显的相互作用.体外GST-融合蛋白沉降技术试验进一步得出CARK4能拉下RCAR12,而不能结合负对照GST,这证明CARK4可以直接与RCAR12相互作用.为了确定CARK4与RCAR12在植物体内是否也存在相互作用,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来进行BiFC实验,结果表明在烟草中共注射CARK4与RCAR12能发激发荧光,而负对照却没有,这说明CARK4与RCAR12在植物体内存在相互作用.研究结果表明,CARK4与RCAR12在植物体内、体外均具有相互作用.     

烟草烟碱转化相关蛋白质筛选分析研究

为了研究烟草中烟碱转化机理,应用比较蛋白组学方法研究了高烟碱烟草中烟碱转化相关蛋白质表达情况.采用双向电泳联用质谱技术比较了实验组高烟碱转化烟草叶片和对照组野生型烟草叶片的蛋白质差异,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了34个差异蛋白质点,采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定,其中在实验组中相对下调的蛋白有7个,相对上调的蛋白有5个.通过比对蛋白质组库数据,发现这些差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢等功能,而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体,表明这些蛋白表达水平与烟碱转化具有密切关系,为研究高烟碱转化率烟叶的形成机理提供了新的依据.     

基于GFP-nanobody的纯化酵母表达RIIIJ-GFP蛋白研究

采用大肠杆菌重组表达GFP-nanobody后,将其与琼脂糖凝胶偶联,对酵母菌分泌表达RIIIJ-GFP蛋白纯化. 荧光显微镜下观察到绿色荧光凝胶珠,SDS-PAGE检测GFP-nanotrap纯化的蛋白条带单一,且胶上可直接观察到GFP绿色荧光. 表明大肠杆菌表达的GFP-nanobody具有生物活性,可高效结合RIIIJ-GFP,这为RIIIJ蛋白功能的研究奠定基础.     

动物血清刺激下的有毒甲藻生长研究

目前有关Pfiesteria piscicidaSte ind inger et Burkholder的摄食行为研究已有相当多的报道,然而这种生物是如何应用蛋白的还没有人做过研究.我们研究了P.piscicida依赖于血清蛋白的生长能力,发现不管添不添加其捕食者Rhodom onassp.,仅仅1 h后,添加了动物血清的实验组就比未添加血清的对照组显示出明显出更快的生长速率,这种活跃的生长至少持续了4 h.当添加了异硫氰酸荧光素的共扼免疫蛋白后,在P.piscicida的细胞中检测到了荧光;第1个小时只能检测到微弱的荧光,此后荧光逐渐增强,到3~4h达到最强.此外,我们还进一步通过蛋白质印迹法来验证P.piscicida细胞对血清蛋白质的吸收.本研究首次提供了沟鞭藻能够消化利用蛋白质的直接证据,并且发现P.piscicida生长响应与动物蛋白的添加几乎是同步的.尽管细胞快速生长机制还有待进一步研究,但我们的发现可能解释了P.piscicida是如何得益于其吞噬摄食方式及如何在鱼类出现时作出快速反应的.     

基于蛋白质组学技术筛查维吾尔族妇女宫颈癌前病变患者血浆蛋白预警标志物

 依托蛋白质二维液相色谱和质谱技术,寻找与新疆维吾尔族妇女宫颈癌癌前病变高度宫颈鳞状上皮内瘤样变(HSIL)相关的血浆预警蛋白标志物,旨在对宫颈癌做到早期预防和诊断。收集维吾尔族HSIL(21例)和宫颈炎(22例)患者血浆标本并制备血浆低丰度蛋白质组样品,通过对蛋白质二维液相色谱系统的分离与鉴别分析,筛选出差异表达的组分,并运用质谱和生物信息学技术进行鉴定和功能识别分析。确定了宫颈炎和HSIL患者的基于蛋白质等电点和疏水性特征的血浆低丰度蛋白质组图谱,筛选出10个差异表达蛋白组分。结果表明,在HSIL患者血浆中3个低丰度蛋白组分含量明显上升,1个组分含量下降;而通过质谱技术鉴定出31种蛋白质,其中4种蛋白质与肿瘤进程密切相关,分别是代谢相关蛋白(APOA1)、信号转导相关蛋白(mTOR、EphA3)和免疫功能相关蛋白(HLA-DQB1)。本文针对维吾尔族妇女这一宫颈癌高发人群,展开癌前病变患者血浆低丰度蛋白组表达水平的研究,鉴定出多种差异表达血浆蛋白预警标志物,为本区宫颈癌的预防和早期鉴别诊断及癌变机制研究提供了依据。     

菜青虫不同生长期相关蛋白的蛋白质组学研究

以不同生长阶段的菜青虫五龄幼虫、预蛹和蛹为材料,通过对3个不同生长阶段的菜青虫双向电泳图谱的比较找到18个差异较明显的蛋白质斑点,并通过质谱分析技术和数据库信息检索最终鉴定出8个蛋白,包括4个代谢相关蛋白(氧化还原酶、组氨酸乙酰转运酶、多胺氧化酶和支酸变位酶)、3个调控蛋白(锌指类蛋白、转座酶、与RNA甲基化酶有关的假想蛋白)和1个与结构E-钙粘附蛋白相似的蛋白,其余10个蛋白质功能皆不明确.本文的结果为进一步研究菜青虫发育相关蛋白奠定基础,同时也为研发以这些差异蛋白为作用靶点的新型生物农药提供理论依据.     

双孢蘑菇耐温差异蛋白质组学研究

利用蛋白质组学和荧光定量PCR方法,研究双孢蘑菇(Agaricus bisporus Lange (Imbach))02菌株在常温与高温胁迫下的蛋白质表达差异,发现了6个差异蛋白质点,经NCBI数据库比对分析,表明6个差异蛋白质分别为HSP70家族的HSS1热激蛋白、异柠檬酸裂解酶、细胞色素P450单氧化酶及3个未知蛋白质.这些蛋白质在双孢蘑菇受热胁迫下具有保护自身稳定的功能.