DJ-1真核表达载体构建及其转染口腔癌细胞的表达

目的:构建人DJ-1真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并转染人口腔癌细胞系Tca8113,建立含有DJ-1真核表达载体的口腔癌细胞模型。方法:以人HEK293细胞为模板,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增人DJ-1基因全长,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,经酶切鉴定和测序分析后,通过脂质体介导法转染人口腔癌细胞系Tca8113,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)和未转染组,最后采用RT-PCR法检测Tca8113细胞中DJ-1基因的表达情况。结果:RT-PCR法获得长度为500 bp左右的阳性产物,重组质粒后经酶切鉴定和序列分析证实真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1构建成功。转染Tca8113细胞后RT-PCR法证实与空质粒组和未转染组相比,转染真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1的细胞系中DJ-1基因表达明显增高。结论:成功构建人真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并建立含有该载体的口腔癌细胞模型,为进一步研究DJ-1基因在口腔癌中的功能及应用DJ-1进行基因治疗奠定基础。     

Hela细胞转染表达ABCA1对其抗砷性的影响

研究含有ATP结合转运子A1基因的真核表达载体pcDNA3.1/ABCA1转染真核细胞后,在细胞中的表达及对细胞抗砷性的影响。由脂质体介导将pcDNA3.1/ABCA1转染入Hela细胞中,用Western-blot方法检测ABCA1蛋白的表达,用MTT法检测48h急性砷染毒后细胞生存率的改变。Western结果显示重组质粒成功转入Hela细胞中且表达良好,MTT结果显示转染重组质粒组细胞在各浓度下生存率均较对照组高。这表明,ABCA1蛋白在真核细胞中相对高表达后增强了细胞的抗砷性。     

MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

局灶性脑梗死后缺氧诱导因子-1α基因的治疗作用及机制研究

目的:构建携带缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,探索HIF-1α在成年大鼠局灶性脑梗死中的治疗作用及可能机制.方法:应用腺病毒表达系统AdEasy System构建携带缺氧诱导因子-1α和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒(Ad-HIF-1α)并行PCR鉴定.建立大鼠线栓法大脑中动脉缺血再灌注模型.分为Ad-HIF-1α、腺病毒空载体(Ad)、生理盐水(NS)三组;将Ad-HIF-1α、Ad和NS分别注射到模型鼠梗死侧侧脑室.通过大体脑解剖和Nissl染色检测模型是否成功,原位杂交检测脑组织HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、SDF-1αmRNA的表达差异,三组大鼠神经功能缺失评分和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评价Ad-HIF-1α对脑缺血的治疗效果.结果:大体脑解剖标本和Nissl染色均证明大脑中动脉缺血再灌注模型成功建立.经氯化铯梯度离心法纯化后Ad-HIF-1α的滴度为8.2×108pfu/ml,PCR鉴定表明Ad-HIF-1α构建成功.三组大鼠脑梗死后HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA的表达均有明显增加,且均于72h达最高峰.Ad-HIF-1α组HIF-1αmRNA、VEGFmRNA和SDF-1αmRNA在72h的表达与Ad和NS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而Ad和NS组比较则差异无统计学意义(P＞0.05).Ad-HIF-1α治疗组72 hAd-HIF-1α治疗组神经功能缺失评分分别为1.6±0.7和0.9±0.6,与Ad组(分别为2.9±0.6和3.2±0.6)和NS组(分别为3.0±0.7和3.2±0.8)比较差异均有统计学意义(P＜0.05).72 h时脑组织TTC染色显示Ad-HIF-1α治疗组梗死体积为81.2 mm3±1.4mm3,与Ad组(173.9 mm3±1.3mm3)和NS组(171.7mm3±6.2mm3)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:HIF-1α基因在成年大鼠局灶性脑梗死中具有积极的治疗作用,其作用机制不仅是通过上调抗缺氧基因或脑保护基因如VEGF的表达使缺氧的组织细胞保持氧稳定及耐受低氧状态,而且还通过上调修复基因如SDF-1α的表达达到修复受损的神经组织和重建神经系统的作用.     

RT-PCR法检测SMMC-7721人肝癌细胞α5 β1整合蛋白mRNA的表达

整合蛋白α5β1是一类存在于细胞表面的细胞粘附分子,在肝癌的发生发展和演进中起着重要的作用.研究了快速定量检测整合蛋白α5β1mRNA表达的RT-PCR方法,结果表明在PCR反应体系中加入25ng到200ngmRNA的逆转录产物呈较好的线性关系,并以此为反应条件测定pcDNA3-α5,pcDNA3-β1质粒共转染或单转染的α5β1.6-7721,α5.3-7721,β1.6-7721细胞株mRNA的表达,表明经pcDNA3-α5,pcDNA3-β1质粒感染后人肝癌细胞株SMMC7721细胞中整合蛋白α5β1的表达有较大幅度的提高,而且α5,β1亚基间可能存在相互的诱导作用.     

基于生物信息学分析EDIL3基因在宫颈癌中的表达及临床意义

目的 探讨表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白I样结构域3(EDIL3基因)在宫颈癌中表达及其对宫颈癌细胞SiHa、HeLa迁移的作用。方法 运用GEPIA、UALCAN、OncoLnc数据库分析EDIL3基因mRNA在宫颈癌组织中的表达水平、基因启动子甲基化状态和预后的意义；采用免疫组织化学染色、Western blot、qRT-PCR分别检测宫颈癌组织和细胞中EDIL3蛋白及EDIL3基因mRNA表达水平；构建EDIL3-pcDNA3.1过表达质粒，转染分为实验组(转染过表达EDIL3-pcDNA3.1质粒)和对照组NC(转染空质粒),transwell实验检测宫颈癌细胞SiHa、HeLa的迁移。结果 生物信息学数据库分析显示EDIL3基因mRNA在宫颈癌组织中低表达并且存在启动子高甲基化(P<0.05),在宫颈癌不同分期中EDIL3基因的表达无差异(P>0.05),EDIL3高表达与宫颈癌患者不良预后相关(P<0.05);免疫组织化学染色、Western blot、qRT-PCR与数据库分析结果一致，在宫颈癌组织和细胞中EDIL3基因均低表达(P<0.05),...     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

胃癌细胞活性与细胞周期相关蛋白表达相关性分析

目的 探讨胃癌细胞活性与细胞周期相关蛋白(CAPRIN1)表达的关系.方法 通过pEGFP-5X-3质粒转染人胃癌细胞SGC-7901,将上调CAPRIN1的表达设为研究组(转染pGEX-5X-3-CAPRIN1质粒),同时设置阴性对照组(转染pEGFP-5X-3空载体质粒)、空白对照组(常规培养).CCK-8法、Transwell小室检测细胞活性;Western blot法检测p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平.结果 转染48 h后,与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平在空白对照组与阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).培养96 h,SGC-7901细胞增殖水平呈上升趋势,在培养48、72、96 h时,与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞增殖水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05).研究组的迁移SGC-7901细胞数为(604.17±58.09)个,明显多于阴性对照组的(316.92±38.78)个、空白对照组的(311.75±40.51)个,差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组和空白对照组比较,研究组SGC-7901细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 上调CAPRIN1的表达可明显提升胃癌细胞的增殖、迁移能力,可能与激活Akt信号通路和CyclinD1蛋白有关.     

pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射抗肿瘤效应的实验研究

目的研究pEgr-Endostatin辐射诱导肿瘤的表达特性及其抗肿瘤作用,为提高临床肿瘤放疗疗效提供实验证据.方法 Western blotting法检测pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射诱导黑色素瘤B16细胞蛋白表达;建立动物模型,用ELISA法检测不同处理组Endostatin的剂量水平,比较不同处理方式的差异.结果 Western blotting法检测结果显示:重组质粒转染的黑色素瘤B16细胞上清中均有Endostatin蛋白表达,而未转染重组质粒的B16细胞和转染空质粒的B16细胞上清中未见Endostatin蛋白表达.ELISA法检测结果表明:体外接受2~10 Gy X射线照射,Endostatin表达水平明显增加,且照射剂量为4 Gy时Endostatin的表达水平最高.2 Gy照射8~72 h后,Endostatin表达水平与假照射组比较明显增加,在48 h时Endostatin表达水平最高.动物实验表明:荷瘤+25 Gy照射组、荷瘤+pEgr-Endostatin照射组、荷瘤+pc DNA3.1+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin+25Gy照射组肿瘤生长率显著低于单纯荷瘤组(P0.05#0.01),荷瘤+pEgr-Endostatin+25 Gy照射组亦明显低于荷瘤+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin组(P0.05#0.01).结论 pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射能使Endostatin蛋白表达增加,从而抑制血管内皮细胞生长、发挥抗肿瘤作用.     

真核延伸因子-1A2基因在宫颈癌侵袭和迁移中的作用研究

目的探讨真核延伸因子-1A2(eEF1A2)基因对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法设计eEF1A2基因的siRNA干扰片段分别转染宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞和C33A细胞,实验组包括:转染Si-eEF1A2-1和SieEF1A2-2的细胞组,未转染的细胞和非干扰转染细胞(NC组)为对照组。采用Western blot方法检测eEF1A2和E-cadherin在宫颈癌细胞中蛋白质表达水平,通过划痕实验和基质胶包被transwell实验分析细胞迁移能力,通过CCK-8实验和平板克隆实验检测细胞增殖。结果宫颈癌细胞中,siRNA干扰的细胞与对照组相比eEF1A2蛋白质表达水平降低,E-cadherin蛋白质表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);划痕实验si-eEF1A2转染的细胞与对照组相比较,愈合间隙宽,差异有统计学意义(P0.05); Transwell迁移实验,RNA干扰的细胞与对照组相比,穿过小室基底膜的细胞明显少于对照组,差异有统计学意义(P0.05); si-eEF1A2干扰的细胞CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验中可以抑制宫颈癌细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。结论降低宫颈癌SiHa、HeLa和C33A细胞eEF1A2基因表达水平,可以抑制癌细胞的侵袭和迁移。     

293T细胞转染表达ARG1及其对砷代谢的影响

研究含有ARGI基因的真核表达载体PcDNA3.1-IE-ARG1转染真核细胞后,在细胞中的表达及对细胞砷代谢的影响。由脂质体介导将PcDNA3.1-IE-ARG1转染入293T中,用real-timePCR方法检测ARG1基因的表达,用原子吸收分光光度法测定24h砷染毒后细胞内砷含量及细胞排砷量。重组质粒成功转入293T细胞中且表达良好;与转染前细胞比较,转染重组质粒的细胞在不同浓度砷染毒下细胞内砷含量明显降低(P0.05),并且细胞的排砷量也高于转染前的;此外,转染表达ARGI基因的细胞在砷染毒48h后其内GSH及GST的含量高于转染前细胞。这些表明,ARG1基因在真核细胞中相对高表达后在砷代谢排出中发挥了一定的作用。     

大鼠csrp2基因真核表达质粒的构建及表达

获得大鼠csrp2,基因片段并构建真核表达载体.RT-PCR法从大鼠心脏组织中提取总 DNA,并扩增出相应大小的csrp2 DNA片段,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染Cos-7细胞,分别以RT-PCR 方法检测mRN-表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA 3.1(-)-csrp2,RTPCR结果证明csrp2,可在cos-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有CRP2蛋白的细胞着染.成功构建了大鼠csrp2基因的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-csrp2,csrp2,基因可以在Cos-7细胞中表达.     

鼠源VCAM-1真核表达载体构建及在同源细胞中过表达研究

构建鼠源VCAM-1基因的真核表达载体,并使其在C2C12细胞中过表达,为相关病毒受体研究奠定基础.采用RT-PCR方法扩增鼠源VCAM-1基因,构建重组载体pcDNA3.1-VCAM-1.通过脂质体法转染至C2C12细胞内;采用实时荧光定量PCR和Western-blot分别检测目的基因和蛋白的过表达情况.应用间接免疫荧光实验分析VCAM-1在细胞中的定位.构建的重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1转染C2C12细胞后,实验组VCAM-1基因和蛋白表达均显著高于对照组细胞(P0.01),且主要表达定位于胞浆中.结果表明,实验成功地构建了鼠源VCAM-1真核表达载体,并在同源细胞中实现过表达.     

SDF-1α改善高糖对骨髓间充质干细胞存活及迁移能力的抑制作用与分子机制的研究

目的:探讨基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)对高糖环境(25 mmol/L)下大鼠骨髓间充质干细胞(r MSCs)存活及迁移能力的影响及相关分子机制.方法:采用全髓贴壁法纯化培养r MSCs,通过MTT法检测细胞增殖率、Hoechst 33258染色从形态学角度观察细胞凋亡评估SDF-1α对高糖环境下r MSCs存活的影响,同时通过transwell实验评估SDF-1α对高糖环境下r MSCs细胞迁移能力的影响.结果:实验结果发现,与低糖培养液(5.6mmol/L)比较,高糖培养液可明显抑制r MSCs增殖、促进细胞凋亡(P0.05),SDF-1α(50 ng/m L)可减轻高糖培养液对细胞增殖的抑制及诱导细胞凋亡的作用(P0.05),CXCR4受体特异性拮抗剂AMD3100(10μg/m L)虽能进一步抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,但差异无显著性(P0.05).Transwell实验发现高糖培养液可明显抑制r MSCs的迁移作用(P0.05),SDF-1α(50 ng/m L)可逆转高糖培养液对细胞迁移的抑制作用(P0.05),AMD3100(10μg/m L)可进一步抑制细胞迁移,且差异有显著性(P0.05).结论:SDF-1α可能通过CXCR4受体改善高糖对骨髓间充质干细胞迁移能力的抑制,而其改善高糖对骨髓间充质干细胞存活的抑制则可能通过非CXCR4受体介导,为改善MSCs用于治疗冠心病合并糖代谢异常患者心梗后心力衰竭疗效进一步提供理论依据.     

趋化素样因子1对肾癌细胞ACHN生物活性的影响及其相关机制

通过质粒转染实现趋化素样因子1(Chemokine-like Factor 1,CKLF1)在肾癌细胞ACHN中过表达, 探究CKLF1对肾癌细胞ACHN细胞增殖和凋亡的影响及机制研究。方法：将实验组pEGFP-N1-CKLF1和对照组pEGFP-N1真核细胞表达质粒分别转染肾癌ACHN细胞,实现趋化素样因子1在ACHN细胞中的过表达。利用荧光显微镜,镜下观察质粒转染效率。利用CCK8实验观察肾癌细胞ACHN转染24、48、72小时后增殖情况;利用流式细胞术检测ACHN细胞转染24、48、72小时后细胞周期的变化情况;利用Hoechst33258染色法观察转染48小时后, ACHN细胞形态变化,利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用Western blot法检测CKLF1过表达后,蛋白Cyclin D1、、Bcl-xL、STAT3、P-STAT3表达情况。结果: 1、荧光显微镜下90%以上的细胞有绿色荧光蛋白表达,证明转染效率良好。2、CCK8检测结果显示：转染48、72小时后,实验组肾癌细胞ACHN的增殖情况均明显高于对照组,差异有显著性意义48小时(P ＜0.05),72小时（P ＜0.05）;3、流式细胞术检测结果显示：实验组增值指数PI明显高于对照组, 差异有显著性意义24h(P ＜0.01),48h(P ＜0.01),72h (P ＜0.01) 。4、 荧光显微镜下Hoechst 染色结果显示：与对照组相比较,实验组凋亡小体数量较少。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比较,转染后48小时后实验组细胞凋亡率明显降低（P ＜0.05）。5、Western blot结果: 与对照组相比较,周期相关蛋白Cyclin D1表达明显高于对照组,差异有显著性意义（P＜0.05）;实验组凋亡相关蛋白Bcl-xL表达量明显高于对照组（P ＜0.05）;实验组JAK-STAT信号通路蛋白P-STAT3明显高于对照组（P＜0.05）。 结论：趋化素样因子1过表达可促进肾癌细胞ACHN的增殖、抑制其凋亡,其发生机制可能与JAK-STAT信号通路有关。CKLF1可能是肾透明细胞癌的新的治疗靶点。     

HIF-1α表达对人乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响

为研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在人乳腺癌细胞中的表达及其与乳腺癌细胞侵袭转移能力的相关性,采用在培养基中加入CoCl2模拟化学缺氧培养细胞,RT—PCR和Western-blot、免疫细胞化学检测HIF-1α在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA—MB-231中mRNA水平和蛋白质水平在缺氧前后的表达差异,及Millicell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测缺氧前后两株细胞侵袭迁移能力的改变．结果发现：缺氧后,两株细胞的HIF-1α mRNA水平和蛋白质水平均较缺氧前增高（p〈0．01）,MDA—MB-231和MCF-7之间有显著差异（p〈0．01）;MDA—MB-231的侵袭转移能力明显增加（p〈0．01）,MCF-7的侵袭转移能力略有增加（p〈0．05）．表明缺氧上调HIF-1α转录及蛋白表达,进而促进乳腺癌细胞的侵袭转移能力．     

高糖、低氧对大鼠心肌微血管内皮细胞新生功能影响的体外研究

目的:探讨高糖、低氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)新生功能的影响.方法:体外培养成年大鼠CMEC,随机分为4组:正常对照组(NG组)、高糖组(HG组)、低氧组(HNG组)和高糖+低氧联合组(HHG组).Real-time PCR法检测各组CMEC的HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平; CCK-8法检测各组CMEC的体外增殖能力;transwell小室实验评价各组CMEC的迁移能力;体外小管形成实验评价各组CMEC的成管能力.结果:(1) HIF-1α的mRNA表达水平:NG组与HG组之间、HNG组与HHG组之间无统计学差异(P 0. 05); HNG组明显高于NG组(P 0. 05),HHG组明显高于HG组(P 0. 05),表明低氧可促进CMEC的HIF-1αmRNA表达. VEGF的mRNA表达水平:NG组与HG组间无统计学差异(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); HNG组明显高于NG组(P 0. 05),HHG组明显高于HG组(P 0. 05),表明高糖可抑制CMEC的VEGF mRNA表达,而低氧可促进其表达.(2)细胞的增殖能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC增殖.(3)细胞的迁移能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC迁移.(4)细胞的成管能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC小管形成能力.结论:高糖对CMEC的HIF-1αmRNA表达的影响不明显,但可明显抑制CMEC的VEGF mRNA表达;低氧可促进CMEC的HIF-1α和VEGF mRNA表达;高糖和低氧均可降低CMEC的增殖能力、迁移能力和成管能力,两者联合时作用更为明显.     

吲哚胺2,3-双加氧酶下调HLA-Ⅰ类分子的表达

目的:探讨人类吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)对细胞表面HLA-Ⅰ类分子的影响.方法:用脂质体法将含IDO基因的重组质粒pEGFP-IDO转染293T细胞,用Western blot检测IDOGFP在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-Ⅰ类分子的表达.结果:Western blot证实转染重组质粒的细胞表达IDO.转染空载体的细胞与转染重组质粒的细胞HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为299.46±62.65及42.51±8.19,两者相比有显著性差异(P＜0.01);转染重组质粒的细胞,未加色氨酸组与色氨酸组HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为309.17±34.89及692.12±33.42,两者相比亦有显著性差异(P＜0.01).结论:IDO下调细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达,色氨酸能够逆转IDO所致的HLA-Ⅰ类分子的下调.     

pEZsiRNA6.1/hHif-1α稳定转染食管鳞癌EC-9706细胞系的建立

利用基因工程技术将合成的HIF-1α shRNA与pEZsiRNA6.1空载体连接,构建pEZsiRNA6.1/hHif-1α载体,PCR和测序结果表明所构建的pEZsiRNA6.1/hHif-1α重组载体正确.进一步将所构建的载体转染人食管鳞癌EC-9706细胞系,利用G418筛选HIF-1α稳定干扰的细胞系,荧光显微镜检测结果表明：稳定转染pEZsiRNA6.1/hHif-1α的EC-9706细胞均有绿色荧光蛋白示踪.经CoCl2诱导模拟缺氧4 h,Western Blot结果显示pEZsiRNA6.1/hHif-1α能有效抑制EC-9706缺氧食管癌细胞HIF-1α的诱导表达.     

新基因FAM172A对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察新基因FAM172A对内皮细胞增殖、凋亡的影响,探索FAM172A在动脉粥样硬化发生发展中的作用.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC,构建FAM172A真核表达载体pcDNA3.1(-)-FAM172A,利用脂质体转染重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)-FAM172A于HUVEC,使其高表达FAM172A;合成靶向干扰FAMA172A表达的siRNA,利用脂质体3000转染siRNA,使其低表达FAM172A;RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测转染效果;使用CCK-8及Ed U细胞增殖检测法检测FAM172A对HUVEC增殖的影响;使用流式细胞仪检测FAM172A对HUVEC细胞凋亡的影响;RT-qPCR、蛋白免疫印迹检测FAM172A对NF-κB表达的影响.结果:RT-qPCR及Western转染效率检测结果显示,重组质粒组FAM172A的mRNA是空白质粒组的33.966倍,蛋白表达是其2.772倍,4组siRNA干扰效率相比,siRNA1162干扰效率最高,FAM172A的mRNA表达降低69.67%,FAM172A蛋白表达降低73.8%;CCK-8与Ed U细胞增殖实验结果显示新基因FAM172A抑制HUVEC的增殖,与空白质粒组相比,转染24、48、72 h后重组质粒组细胞在450nm波长处吸光度A450值降低,细胞增殖率降低,相反,靶向干扰基因FAM172A的表达后,A450值升高,细胞增殖率升高.流式细胞技术细胞凋亡检测结果显示新基因FAM172A促进HUVEC凋亡,与空白质粒组相比,转染重组质粒组Annexin V阳性比增加;靶向干扰基因FAM172A的表达后,Annexin V阳性比降低.RT-qPCR和Western blot结果显示,与转染空白质粒组相比,转染FAM172A重组质粒组,NF-κBp65表达增高(2.033∶1.050);与干扰对照组相比,干扰FAM172A表达时,NF-κBp65表达降低(0.366∶0.996).结论:新基因FAM172A能够抑制人脐静脉内皮细胞的增殖,促进细胞凋亡,其可能通过NF-κB通路参与调控人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的.