聚离子亚基化合物介导的基因转移方法可用于外源基因的瞬时表达

利用聚离子亚基化合物介导的基因转移方法，研究了外源β－半乳精苷酶报告基因的瞬时表达．结果表明聚离子亚基化合物介导的基因转移方法可用于外源基因的瞬时表达研究，而且在相同的条件下，用该方法在NIH3T3细胞和PA317细胞中对报告基因转移的效率要高于磷酸钙法和脂质体法．实验结果还表明聚离子亚基化合物的结构影响外源基因转移效率．     

HCAP1基因对Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax/Bcl - 2的作用

目的：研究外源HCAP1基因产物对Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax／Bcl-2的作用。方法：用脂质体介导的基因转移方法，把外源HCAP1基因转染到Raji细胞中，用流式细胞术和Hochest 33258荧光染色检测细胞凋亡；用Western blot检测外源HCAP1基因对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2蛋白表达的调节。结果：外源HCAPl基因导入Raji细胞24、48和96h后，细胞凋亡率增加。Western blot显示Bax／Bel-2蛋白表达比值明显增高。结论：转染外源性HCAP1基因可诱导Raji细胞凋亡，使Bax／Bcl-2蛋白表达比例上调可能是HCAP1诱导凋亡的机制之一。     

拟南芥VHA-c3基因的特异性表达和调节

利用RT-PCR技术检测VHA-c基因在拟南芥中的表达，结果表明VHA-c3基因在拟南芥的果荚、花、叶、茎和根中都有表达，但是，在叶中的表达量远远高于其它的组织.以GUS基因作为报告基因构建了不同长度的VHA-c3基因启动子缺失突变体，利用农杆菌介导的瞬时表达系统检测GUS基因的表达，研究发现在VHA-c3基因起始密码子上游2812-2 234 bp之间的区域內存在着控制VHA-c3基因高表达的转录调控元件.     

外源基因在蓝太阳鱼胚胎发育过程中的表达

通过基因重组,将石斑鱼生长激素基因编码序列克隆到鲤鱼β-actin基因启动子下游,构建成全鱼基因重组子.采用显微注射法将报告基因GFP基因导入蓝太阳鱼受精卵中,研究了外源基因在鱼类胚胎发育中的整合与表达的时序.结果表明GFP在原肠末期开始表达,一直到鱼苗期并未出现表达量的衰减,并表现为嵌合性表达.在受体胚胎早期,外源基因的表达与基因构型和注射的剂量有关,环形质粒的表达要略高于线形质粒,较高浓度的外源基因的表达效率要高.同时将GFP基因与全鱼基因重组子进行了共转移,结果表明两种独立的基因在受体中的整合或表达没有必然的联系.     

甘蓝型油菜瞬时表达系统研究

本文利用PEG介导外源基因转化甘蓝型油菜叶肉原生质体，以花椰菜花叶病毒35S启动子启动荧光素酶基因作为瞬时表达实验的报告基因，对PEG转化液配方、渗透压稳定剂、转化供受体配比等转化过程中的关键影响因素进行考察优化，建立起稳定高效的油菜瞬时表达系统.     

鸡溶菌酶A元件在大豆中对uidA基因瞬时表达的影响

本研究将报告基因uidA(β-葡糖苷酶基因)两侧各含有一个鸡溶菌酶A元件(chiMAR)的中间表达载体pLM9与不含chiMAR的中间表达载体pLM5经农杆菌介导转化大豆,以研究chiMAR对外源uidA基因瞬时表达的影响.结果表明,在大豆品种科丰6号和冀豆12中,chiMAR均能显著提高uidA基因的瞬时表达率(p<0.01),并且chiMAR对不同品种中uidA基因瞬时表达率的影响不同;在科丰6号中,chiMAR对uidA基因的瞬时表达量没有显著影响,但能够降低uidA基因瞬时表达的个体差异度;chiMAR可以显著降低uidA基因在冀豆12中的瞬时表达量(p<0.01),同时提高uidA基因瞬时表达的个体差异度.     

用微弹轰击法将GUS基因导入香蕉茎尖组织细胞

用在弹轰击法将外源ＤＮＡ导入香蕉（Ｍｕｓａ，ｓｐｐ）茎尖细胞，以ＧＵＳ基因作为报告基因，用Ｘ－Ｇｌｕｃ浴液对ＧＵＳ基因表达产物进行组织化学鉴定。样品材料细胞中发现有明显的蓝色斑点，而对照则没有。实验说明用微弹轰击法可以将外源基因导入香蕉茎尖组织并在其中成功表达，这为香蕉的外源基因导入工作提供了新的有效途径．     

根癌农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位研究

采用根癌农杆菌介导的方法,以受控于CaMV35S启动子的携带有GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-GFP转化洋葱表皮细胞.荧光显微镜下观察结果显示,GFP基因在经浸染和共培养后的洋葱表皮细胞中得到了表达,绿色荧光分布在细胞核和细胞质中,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础.     

水稻原生质体高频分裂及基因转化

从粳稻品系８９８和籼稻不育系珍籼Ａ的悬浮细胞系中制备的原生质体，分裂频率分别达１８．９％和３５％。低压脉冲电泳仪介导外源基因转移的水稻原生质体，分裂频率也在１０％以上，转化的小细胞团中检测到外原基因Ｇｕｓ的表达，对原生质体的制备、培养及转化作了下述改进：（１）添加２μｇ／Ｌ２，４－Ｄ的Ｎ６培养基培养悬浮细胞及原生质体可获高频分裂，添加０．３μｇ／Ｌ６－ＢＡ或０．１μｇ／Ｌ ＮＡＡ不利于分裂；（２）     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。     

PARP抑制剂诱导外源整合基因删除的作用特点

构建能表达LacZ基因和c-Ha-T24ras基因的两种真核表达重组质粒A13.4和B12.7（两基因相对位置不同），并将其转染NIH3T3细胞和HeLa细胞，经G418筛选，分别建立了四种稳定转化细胞系A13.4-NIH3T3、B12.7-NIH3T3、A13.4-HeLe及B12.7-HeLa。用聚ADP核糖聚合酶（PARP）的NAD位点抑制剂苯甲酰胺（BA）分别处理四种转化细胞后，检测细胞中整合的外源LacZ基因与c-Ha-T14ras基因的删除情况，结果如下：BA诱导的基因删除可发生于NIH3T3转化细胞系，但不能发生于HeLa转化细胞系；位于同一外源表达载体上的LacZ基因与c-Ha-T24ras基因的删除过程是同步的；外源整合DNA片段的转录强度可能直接影响其被BA诱导删除的敏感性。     

外源基因导入部分脱壁的大麦细胞及其转基因植株的再生

采用ＰＥＧ法、电击法以及ＰＥＧ＋电击法将带有ｇｕｓ和ｎｐｔⅡ基因的ｐＢＩ１２１质粒导入部分脱壁的大麦细胞，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＧＵＳ和ＮＰＴⅡ蛋白活性检测，证实了外源报告基因已在大麦基因组中整合并在转化细胞中获得表达。     

家蚕精子介导报告基因gfp和egfp转移技术的研究

探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中，使之稳定遗传．分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验．结果表明，导入线性pG350载体，在14个G0代实验蛾区的DNA样品中，有5个PCR检测为阳性，阳性率为35．7％；对G1代的PCR与Southern blot检测的结果证明，导入的gfp基因存在于G1代的家蚕基因组中．导入不同浓度或构型的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体时，对G0代的PCR检测结果表明，导入线性pMD-Fib-IE-EGFP组的PCR阳性率为61.2％，而导入环状质粒组的PCR阳性率为57．1％；导入环状pEGFP-N3组的PCR阳性率为46．2％；对部分PCR阳性蛾区进行Southern blot检测结果表明，导入的egfp基因整合在G0代家蚕基因组中．本研究的结果表明，家蚕精子介导基因转移能够将外源基因有效地导入、整合于家蚕基因组，并可遗传至G1代．     

用电穿孔法将外源基因高效导入水稻胚盾片细胞

利用电穿孔法将外源基因导入未经前处理的水稻成熟胚盾惩细胞，质粒为ｐＡＣＴ１－Ｆ，其上带有受水稻肌动蛋白基因ａｃｔｉｎ１启动控制的ＧＵＳ（ｕｉｄＡ）报告基因，电穿孔实验的条件为１００μｇＤＮＡ／ｍｌ缓冲液，３１０Ｖ／ｃｍ场强及９００μＦ电容，通过ＧＵＳ基因瞬时表达实验室证明只需一次脉冲处理便可在一个胚上获得几十个数百个转化细胞，并且发现盾片细胞较胚上其它部位的细胞更易于转化。     

β—半乳糖苷酶基因在HeLa细胞中瞬时表达的动态研究

本文研究了由ＳＶ４０早期启动子和增强子启动的β－半乳糖苷酶基因在ＨｅＬａ细胞瞬时表达的动态情况。外源β－半乳糖苷酶基因经磷酸钙方法导入受体细胞５０ｈ后其酶活性为６０ｍｉｌｌｉｕｎｉｔｓ，该酶活性维持一段时间后呈下降趋势，经转染２７０ｈ后，该酶活性降为０。此外本文结果还表明，携带有β－半乳糖苷酶基因的质粒对受体细胞ＨｅＬａ具有较高的转染效率。     

利用反义RNA探索外源基因丢失的分子机理

利用反义ＲＮＡ技术研究了调控ＰＡＲＰ酶基因的表达对外源基因整合稳定性的影响。将ＰＡＲＰ基因ｃＤＮＡ的部分序列反向插入到真核表达载体ｐＳＭＧ中,将重组质粒分别导入携带有外源基因的细胞中,地塞米松诱导反义ＰＡＲＰ基因的表达后,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测。结果表明,外源基因仍保留在基因组中,这意味着外源基因的丢失并不是由于单一ＰＡＲＰ酶活性降低所致。     

利用RNAi技术鉴定哈茨木霉聚酮合酶基因pkst-1的功能

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是优良的生物防治真菌,能产生抗生性聚酮化合物(polyketides).目前没有关于催化木霉聚酮化合物合成的聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)的相关编码基因的报道,这限制了对聚酮化合物代谢合成途径的研究.该研究通过融合PCR技术获得哈茨木霉的聚酮合成酶pkst-1基因的编码区序列,成功构建了RNAi介导的pkst-1基因沉默表达载体,使pkst-1基因的表达量在mRNA水平上显著降低.pkst-1基因失活使转化子发酵液产生了类似基因敲除的抑菌效果,降低了哈茨木霉抑菌能力,研究表明pkst-1基因编码催化抗生性聚酮化合物合成的关键酶.此外,RNA干扰技术在研究中的成功应用为哈茨木霉或其它丝状真菌的次级代谢合成途径相关基因的功能鉴定提供新的研究思路.     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

微束激对单细胞诱变机制研究

本文报道用微束激光对家蚕进行外源染色质的转移获得成功，观察到转移的染色质基因在受体中的当代形态性状表达，并论述短脉冲微束激光照射家蚕 精卵大细胞转移外源基因的同时，引起变异的主要机制。     

CTLL—2／MTT法快速测定IL—2基因转移效率的研究

应用包装ＩＬ－２基因的逆转录病毒载体，将ＩＬ－２基因导入小鼠成纤维细胞ＮＩＨ－３Ｔ３和小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，建立了ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－２，ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－７和Ｂ１６／ＩＬ－２－４等３个转基因细胞株，应用ＣＴＬＬ－２／ＭＴＴ法快速测定各转基因细胞株分泌上清ＩＬ－２的浓度．转染效率最高的ＮＩＨ－３Ｔ３／ＩＬ－２－７其ＩＬ－２分泌量高达１４２２ｕ／（１０６ｃ·２４ｈ），表明这一基因转移系统能有效地将外源基因导入靶细胞．ＣＴＬＬ－２／ＭＴＴ法能快速、简便、有效地检测ＩＬ－２的表达．